Transformação genética de laranjeira doce com genes da via biossintética de carotenoides

Autor: Pinheiro, Thaísa Tessutti
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2014
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Druh dokumentu: Tese de Doutorado
Popis: Plantas de Citrus regeneradas de tecidos juvenis demandam um longo período para a análise do fenótipo resultante em flores ou frutos. Este trabalho apresenta o mutante espontâneo de florescimento precoce de laranja doce, denominado \'x11\', como modelo para estudos de genômica funcional de Citrus. As frutas cítricas são ricas em carotenoides, pigmentos que possuem grande valor nutricional, como pró-vitamina A (?- ou ?-caroteno). Estudos de genômica funcional envolvendo genes da via biossintética dos carotenoides terão resultados rapidamente obtidos utilizando-se variedades com florescimento e frutificação precoce, como a laranjeira doce mutante \'x11\'. A laranjeira doce \'Sanguínea-de-Mombuca\' (SM) é uma variedade de polpa vermelha que acumula licopeno na polpa dos frutos, podendo ser considerada uma importante ferramenta no estudo da acumulação de carotenoides nos frutos de laranjeiras. Desta maneira, o objetivo deste estudo foi estabelecer a laranjeira \'x11\' como planta-modelo em experimentos de transformação genética visando estudos de genômica funcional dos genes PSY (fitoeno sintase), PDS (fitoeno desaturase), CRTISO (carotenoide isomerase), LCY-b (licpeno ?-ciclase) e ?-caroteno hidroxilase (HYb), envolvidos na biossíntese de carotenoides e utilizar a laranjeira SM como ferramenta no entendimento da acumulação dos carotenoides nos frutos de Citrus. Plantas de laranjeira \'x11\' foram transformadas com promotor de expressão preferencial para órgãos reprodutivos de Citrus controlando a expressão de gene repórter (gusA) para a análise da tecido especificidade. Foi realizada a otimização do protocolo de transformação genética de segmentos de epicótilo de laranjeira \'x11\' via Agrobacterium. A eficiência de transformação média foi de 18,6%, mas atingiu 29,6% no protocolo otimizado. Das 270 brotações positivas, cinco foram microenxertadas e aclimatizadas. Quatro dessas plantas exibiram as primeiras flores em três meses após o estabelecimento ex vitro, e a outra, dois meses mais tarde, independentemente da época do ano. A coloração histoquímica da atividade do gene gusA foi realizada em segmentos de caule, flores e frutos de plantas transgênicas aclimatizadas, com 5-7 meses de idade, confirmando a expressão constitutiva do gene gusA nesses órgãos. As plantas transformadas com a construção para o teste do promotor de expressão preferencial para órgãos reprodutivos de Citrus continuam em fase de desenvolvimento. Em seguida foi realizada a transformação genética de laranjeira \'x11\' para a superexpressão dos genes PDS e LCY-b1 e para a superexpressão do gene LCY-b1 e HYb em laranjeira SM. Também foi realizada a transformação genética de \'x11\' para o silenciamento do gene CRTISO e HYb e também para o silenciamento do gene CRTISO, em SM. A quantificação da expressão do gene-alvo em tecido foliar foi correlacionada ao número de cópias do cisgene inseridos em cada planta, revelando que o nível de expressão gênica não foi diretamente ligado ao número de cópias inseridas no genoma. Uma planta de laranjeira \'x11\' superexpressando o gene LCY-b1 frutificou e foi realizada a análise do perfil de carotenoides totais em relação ao fruto de uma planta não transformada. Neste evento houve aumento no teor de carotenoides totais e xantofilas, indicando o potencial da manipulação dos genes codificadores de enzimas da via biossíntese de carotenoides para alterações quantitativas e qualitativas destes pigmentos
Considering the perennial developmental phase of Citrus, plants regenerated from juvenile tissues require long period for analysis of the resulting phenotype in flowers or fruits. Herein, we present the spontaneous sweet orange mutant named \'x11\', as a model plant for functional genomics studies in Citrus due to the remarkable feature of early-flowering. Citrus fleshy fruits are rich in carotenoids which are pigments that have great nutritional value, such as pro-vitamin A (?- or ?-carotene). Functional genomics studies involving genes related to carotenoids biosynthesis pathway can be rapid generated by using the early flowering mutant, \'x11\' in sweet orange background. The fleshy fruit from the sweet orange \'Sanguínea-de-Mombuca\' (SM) has a red pulp due to accumulation lycopene that may be considered an important tool to investigate the accumulation of carotenoids in sweet orange fruits. Therefore, the aim of this study was to establish the orange mutant \'x11\'as model plants for genetic transformation and functional genomics analysis of key regulatory genes PSY (phytoene synthase), PDS (phytoene desaturase), CRTISO (carotenoid isomerase), LCY-b1 (licopene ?-cyclase) and ?-carotene hydroxylase (HYb) involved in the biosynthesis of carotenoids and to use the sweet orange SM as a tool in understanding the accumulation of carotenoids in sweet orange fruits. The mutant plants \'x11\' were transformed with gene reporter (gusA) under control of specific promoter for reproductive organs in Citrus for the tissue specificity analysis. We report a procedure for efficient regeneration and transformation using epicotyl segment explants of \'x11\' and Agrobacterium tumefaciens as a proof-of-concept. The average transformation efficiency was 18.6%, but reached 29.6% in the best protocol tested. Among 270 positive shoots, five were micrografted and acclimatized. Four of these plants exhibited the first flowers within three months after ex vitro establishment, and the other, two months later, regardless the period of the year. Transgenic plants harboring specific promoter for reproductive organs in Citrus are still under development. We transformed \'x11\' for overexpression of PDS or LCY-b1 genes, and to overexpress LCY-b1 or HYb in SM sweet orange. \'x11\' was transformed to silence CRTISO or HYb, and CRTISO gene in SM sweet orange. Then, quantification of target gene expression in leaf tissue was performed by correlating this information with the number of copies of cisgene inserted into each plant. According to the results, it is suggested that the level of gene expression is not directly linked to the number of copies inserted into the genome.One transgenic plant of \'x11\' overexpressing LCY-b1 produced flowers and fruits and the carotenoid profile analysis indicated an increased in content of total carotenoids and, especially, xanthophylls, clearly indicating the potential to manipulate expression of genes encoding enzymes of the carotenoid biosynthetic pathway to obtain qualitatively and quantitatively changes of these pigments
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