Identificação dos mecanismos de letalidade da própolis em Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans

Autor: Castro, Patrícia Alves de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2012
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Druh dokumentu: Dissertação de Mestrado
Popis: A própolis é uma mistura resinosa complexa de várias substâncias coletada de plantas pelas abelhas. Ela tem atraído atenção devido à variedade de suas propriedades biológicas e terapêuticas. Diversos estudos têm mostrado a conexão existente entre a morte celular tipo-apoptose em fungos e importantes processos biológicos como desenvolvimento, envelhecimento, resposta a estresse e patogênese. Neste contexto, este projeto avaliou a atividade antifúngica da própolis, com o objetivo de ampliar os conhecimentos acerca das vias metabólicas de morte celular em fungos, como S. cerevisiae e C. albicans, e também em relação à utilização da própolis como uma terapia antifúngica mais efetiva. Inicialmente, utilizou-se S. cerevisiae com o objetivo de compreender como a própolis afeta fungos ao nível celular. Foi observado que ela é capaz de induzir uma resposta de morte celular apoptótica. No entanto, a exposição aumentada à própolis promove um correspondente aumento na resposta tipo necrose. Verificou-se ainda que o citocromo c, mas não a endonuclease G Nuc1p, está envolvido na morte celular mediada por própolis em S. cerevisiae. Também foi observado que o gene da metacaspase YCA1 é importante para a morte celular induzida por esta substância natural. Para elucidar as funções dos genes que poderiam ser necessários para a sensibilidade à própolis em eucariotos, realizou-se um screening da coleção completa com cerca de 4800 cepas haplóides com genes únicos deletados de S. cerevisiae. Foram identificadas 138 cepas que apresentaram diferentes graus de sensibilidade à própolis quando comparadas com a cepa do tipo selvagem correspondente. Na análise deste screening por biologia de sistemas e também através do perfil transcripcional de S. cerevisiae exposto à própolis, foram observados genes envolvidos na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, da acidificação vacuolar, da regulação negativa da transcrição do promotor da RNA polimerase II, da regulação da macroautofagia associada com a proteína alvo para vacúolo e da resposta celular à privação de nutrientes. Os estudos de validação indicaram que a sensibilidade da própolis é dependente da função mitocondrial e que a acidificação vacuolar e autofagia são importantes para a morte causada por própolis em leveduras. Para o fungo patogênico C. albicans, foi observado que a própolis induz uma morte celular do tipo necrose; observou-se ainda que o gene IPF4847 (homólogo para o gene da metacaspase YCA1 de S. cerevisiae) é importante para a morte celular mediada por própolis. Além disso, com o objetivo de tentar esclarecer algumas funções de genes que poderiam estar envolvidos na sensibilidade à própolis de C. albicans, 800 mutantes deletados de C. albicans foram escaneados e destes, 51 apresentaram maior sensibilidade a própolis quando comparados com as cepas do tipo selvagem correspondente. Vários genes observados em nosso \"screening\" estão envolvidos na transição dimórfica em C. albicans. Desta forma, foi realizado um ensaio a fim de se verificar o papel da própolis na inibição da transição dimórfica e foi observado que este composto inibe não só a transição dimórfica como também o crescimento de todos os morfotipos (levedura, hifa, e pseudohifa) de C. albicans. Desta maneira, o uso da própolis para o tratamento clinico da candidíase pode ter grande aplicação, principalmente por afetar um mecanismo importante para a patogenicidade deste fungo
Propolis is a complex mixture of several resinous substances which are collected thorn plants by bees. Propolis has attracted the attention of researchers because of its variety of biological and therapeutic properties. Studies have shown the connection between Propolis and apoptosis-like cell death in fungi and other important biological processes such as development, aging, stress response and pathogenesis. In this context, this project evaluated the antifungal activity of Propolis, With the aim of expanding the knowledge about the metabolic pathways of cell death in fungi such as S. cerevisiae and C. albicans, and also in relation to the use of propolis as an effective antifungal therapy. For this, initially we utilised S. cerevisiae as a model organism to study the genetics, cell biology and genomics that determine how propolis affects fungi at the cellular level. Propolis is able to induce an apoptosis cell death response. However, increased exposure to propolis provides a corresponding increase in the necrosis response. We showed that cytochrome c, but not endonuclease G (Nuc1p), is involved in propolis-mediated cell death in S. cerevisiae. We also observed that the metacaspase YCA1 gene is important for propolis-mediated cell death. To elucidate the gene functions that may be required Or propolis sensitivity in eukaryotes, the full collection of approximately 4,800 haploid S. cerevisiae deletion strains was screened for propolis sensitivity. We were able to identify 138 deletion strains that have different degrees of propolis sensitivity compared to the corresponding wild-type strains. Systems biology revealed enrichment for genes involved in the mitochondrial electron transport chain, vacuolar acidification, negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter, regulation of macroautophagy associated with protein targeting to vacuoles, and cellular responses to starvation. Validation studies indicated that propolis sensitivity is dependent on mitochondrial function and. that vacuolar acidification and autophagy are important for S. cerevisiae cell death caused by propolis. For the pathogenic fungus C. albicans it was observed that propolis induces cell death like necrosis. It was also observed that the IPF4847 gene (homologous to the YCA1 metacaspase gene of S. cerevisiae) was also important for cell death mediated by propolis in C. albicans. Furthermore, aiming to clarify some of the functions of genes that could be involved in C. albicans sensitivity to propolis, 800 C. albicans deletion mutants were screened, and 51 showed greater sensitivity to propolis compared with the corresponding wild-type strains. Several genes found in our screening were involved in the dimorphic transition of C. albicans. Thus, an assay was performed in order to verify the role of propolis in the inhibition of the dimorphic switch. It was observed that propolis can inhibit the dimorphic transition and the growth of all its morphotypes (budding hyphal and pseudohyphal) in C. albicans. So, the use of propolis for clinical treatment of Candidiasis may have a wide application, principally by affecting an important mechanism for the pathogenicity of fungi
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