Avaliação da variabilidade fenotípica e molecular de isolados de \'Candida albicans\' após período de armazenamento das culturas e em duas ocasiões de coleta

Autor: Bacelo, Kátia Leston
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2008
Předmět:
Druh dokumentu: Dissertação de Mestrado
Popis: O gênero Candida é responsável pela maioria das infecções fúngicas nosocomiais. A identificação do provável foco de origem é de extrema importância para elucidar a epidemiologia desse tipo de infecção e nesse sentido, a utilização de métodos de tipagem, que avaliam características fenotípicas e moleculares dos isolados, é essencial. Assim, o objetivo desse estudo foi tipar isolados de C. albicans, antes e após armazenamento e em diferentes ocasiões de coleta, a fim de verificar a manutenção dos biotipos apresentados, e o poder de discriminação dos métodos utilizados. Foi avaliada a microbiota leveduriforme da saliva de 73 estudantes universitários (tempo 0) sendo que após 180 dias (tempo 180) foi realizada nova coleta de saliva daqueles que apresentaram isolamento de C. albicans na primeira coleta. Os isolados foram analisados por ocasião das duas coletas, quanto à produção de exoenzimas fosfolipase e proteinase, pela morfologia das colônias, pelo perfil de suscetibilidade frente à anfotericina B, fluconazol e itraconazol e pela tipagem molecular por RAPD. As leveduras, após isoladas, foram armazenadas em ágar Sabouraud dextrose (ASD) e água destilada esterilizada. Após 180 dias, foram realizadas, novamente, as provas de tipagem. Todos isolados de C. albicans foram produtores de fosfolipase, nas duas coletas, embora tenha havido oscilação de atividade enzimática entre moderada e alta, no período. O enzimotipo prevalente nos tempos 0 e 180 foi, respectivamente, 22 e 32. Com relação à proteinase, 100% das leveduras apresentaram atividade moderada da enzima no tempo 0. No tempo 180 esse percentual foi de 85%, sendo que os demais não apresentaram atividade dessa enzima. Após armazenamento em ASD e água destilada, foi detectada alteração da atividade de ambas enzimas e conseqüente mudança de enzimotipos, em 40 e 30% dos isolados, respectivamente. Foram identificados 8 morfotipos diferentes de C.albicans no tempo 0 e apenas 50% foi mantido no tempo 180. O morfotipo mais comum foi 000-0. Após armazenamento, a maioria dos isolados apresentou alteração no morfotipo. Todos isolados mostraram-se sensíveis aos antifúngicos analisados nos tempos 0 e 180, denotando apenas um antifungotipo, o 111. Somente um isolado após estocagem em ASD, teve mudança de perfil de sensível para dose dependente ao itraconazol de modo que o antifungotipo foi alterado. A tipagem molecular por RAPD, com os primers OPA-09, OPB-11 e OPE-18, mostrou 19 tipos moleculares distintos entre os isolados obtidos na primeira coleta e permitiu identificar que um isolado de C.albicans obtido no tempo 180, não era relacionado ao obtido, do mesmo indivíduo, no tempo 0. Os demais mostraram perfil de fragmentos de DNA relacionado entre as coletas. Após estocagem, por ambos métodos, todos isolados mostraram correlação genética com o padrão obtido no tempo 0. Os resultados obtidos demonstram que os métodos de conservação aplicados neste estudo não permitem a manutenção da estabilidade das características fenotípicas avaliadas. Por outro lado, além da estabilidade dos biotipos gerados, a tipagem molecular por RAPD mostrou o melhor índice discriminatório, dentre as metodologias utilizadas, ratificando sua capacidade em diferenciar isolados, de uma mesma espécie e, portanto a sua utilidade em inquéritos epidemiológicos.
The Candida genus is responsible for most nosocomial fungal infections. The identification of the probable origin focus is very important to elucidate the epidemiology of this kind of infection and so, the usage of typing methods that evaluate phenotypic and molecular characteristics are essential. Therefore, the objective of this study was to type C. albicans isolates, before and after culture storage and in two different collection occasions to verify the biotype maintenance and the discriminatory power of the utilized methods. The salivary yeast microbiota of 73 university students (time 0) was evaluated and after 180 days (time 180) a new saliva collection of those that had presented C. albicans on the first collection was made. The isolates were analysed, in the two collection occasions on the basis of exoenzymes phospholipase and proteinase production, by colonial morphology, susceptibility profile to amphotericin B, fluconazole and itraconazole and according to molecular typing by RAPD. After isolation, the yeasts were storaged on Sabouraud dextrose agar (SDA) and in sterile distilled water. After 180 days, typing tests were carried out again. All C. albicans isolates were phospholipase productors, in both collections, even though enzyme activity had oscillated between moderate and high at that period. The prevalent enzymotype at time 0 and 180 were, respectively, 22 and 32. In relation to the proteinase, 100% of the yeasts showed moderate enzyme activity at time 0. At time 180, this percentage was 85%, and the others didn`t show enzyme activity. After storage on SDA and in distilled water, it was detected activity alteration of both enzymes and consequent enzymotype change, in 40 and 30% of isolates, respectively. Eight different C. albicans morphotypes were identified at time 0 and just 50% were maintained at time 180. The most common morphotype was 000-0. After storage most isolates presented changes in the morphotype. All isolates showed susceptibility to the analysed antifungals at times 0 and 180, showing just one antifungaltype, the 111. Only one isolate, after storage on SDA had a profile change from susceptible to dose dependent susceptible to itraconazole in a way that the antifungaltype wasn`t changed. The molecular typing by RAPD, with primers OPA-09, OPB-11 and OPE-18, showed 19 distinct molecular types among first collection isolates and allowed to identify that one C. albicans isolate from time 180 wasn`t related with the isolate obtained at time 0, from the same individual. The others showed DNA fragment profiles related between collection occasions. After storage by both methods, every isolate showed genetic relatedness with the profile obtained at time 0. The obtained results showed that the preservation methods used in this study don`t allow stability maintenance of the phenotypical characteristics evaluated. On the other hand, besides biotypes generated stability, the molecular typing by RAPD showed the best discriminatory index, between methodologies used, ratifying its ability in discriminating isolates of the same specie and so, its utility in epidemiological inquiries
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