Desenvolvimento de estratégia de genotipagem para discriminação de alelos antitéticos do sistema de grupo sanguíneo Diego utilizando pool de DNA

Autor: Carvalho, Thiago Vianna de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2018
Předmět:
Druh dokumentu: Dissertação de Mestrado
Popis: Nesta dissertação, foi proposto o desenvolvimento de uma metodologia molecular por PCR em tempo real (qPCR) utilizando pool de DNA para a detecção de alelos que codificam antígenos importantes do sistema de grupo sanguíneo Diego. Esta ferramenta molecular será útil uma vez que são escassos os reagentes sorológicos para detecção desses antígenos e, quando existem, não permitem uma investigação em larga escala devido à pouca confiabilidade e alto custo. O sistema Diego (DI) possui 22 antígenos, sendo o antígeno Diª mais importante na prática transfusional. Eles são carreados pela proteína da Banda 3 que é proteína mais abundante na s hemácias, com 106 cópias. O antígeno possui uma maior prevalência, em indígenas americanos e asiáticos (6%-52%), já que é considerado um marcador antropológico de ancestrais mongóis; no entanto, a incidência desse antígeno tem aumentado dentre outras populações, como em caucasianos e afrodescendentes, e detectado em doadores de sangue, o que pode resultar em aloimunização de pacientes e dificultando o seu manejo terapêutico. Em contrapartida, a frequência do antígeno Dib em todas as populações é extremamente alta (>99,99%) e encontrar o raro fenótipo Di (a+b-) é ainda mais laborioso do que a busca pelo antígeno Diª. Sabe-se ainda muito pouco sobre a frequência dos antígenos Wrª e Wrb nas diferentes populações, mas estimase que a prevalência seja de 0,01% e >99,99% respectivamente. Foram utilizadas 410 amostras de doadores de sangue e 230 amostras de pacientes para genotipagem em qPCR utilizando pool de DNA para detecção dos alelos DI*01, DI*02, DI*02.03 e DI*02.04. A amplificação individualizada foi realizada quando a reação com pool demonstrou a amplificação de um dos alelos de interesse, DI*01 ou DI*02.03. Procedeu-se também com a clonagem dos alelos após à amplificação com as amostras controle, porém, ocorreu somente a clonagem dos alelos DI*02 e DI*02.03. Os fragmentos clonados apresentaram amplificação excelente e serão utilizados como controle positivo em testes moleculares futuros. Não foi possível a clonagem do DI*01 pelo problema da zigozidade da amostra controle. Houve 100% de concordância entre o resultado da genotipagem e as informações de fenotipagem das amostras controle. O alelo DI*01 ocorreu em 0,6% dos doadores de sangue e 1,7% em afrodescendentes, que corresponde a uma frequência genotípica DI*01/DI*02 de 1,2% e 1,3% respectivamente. Procedeu-se com as análises estatísticas comparativas entre o resultado desta pesquisa e de outras na população brasileira sobre os diferentes genótipos para entender se havia uma diferença estatística considerável. Ainda que a frequência para o genótipo DI*01/DI*02 seja mais baixa em doadores e mais alta em afrodescendentes do que o publicado em outros trabalhos brasileiros, a análise dos dados demonstrou que não havia diferença estatística com a maioria deles. A incidência aumentada do alelo DI*01 na população afrodescendente demonstra o aspecto da miscigenação. Conclui-se que a metodologia proposta funciona e tem aplicabilidade imediata em doadores de sangue e na busca de fenótipos raros. A incidência do alelo para Diª em doadores de sangue está abaixo do que um estudo anterior detectou em Ribeirão Preto (COZAC, 2004), que pode ser explicado pelas diferenças no censo populacional entre os estudos e pela coleta de amostra de universitários (62%). Não foram encontrados os genótipos DI*01/DI*01, DI*02.03/DI*02.03 e DI*02.03/DI*02.04 nas populações estudadas.
This work proposed the development of a molecular methodology by Real Time-PCR (qPCR) using DNA pool for the detection of alleles that encode important antigens of the Diego blood group system. This molecular tool will be useful since the serological reagents for the detection of these antigens are scarce and, when they exist, do not allow a large scale investigation due to the low reliability and high cost. The Diego (DI) system has 22 antigens, the Diª antigen is the most important in transfusion practice. They are carried by the Band 3 protein which is the most abundant protein on the erythroid surface, about 106 copies. The antigen has a higher prevalence in american indians and asians (6%-52%), since it is considered an anthropological marker of Mongolian ancestors; however, the incidence of this antigen has increased among other populations, such as in caucasians and afrodescendants, and detected in blood donors, which may result in alloimmunization of patients and make difficult their therapeutic management. In contrast, the frequency of Dib antigen in all populations is extremely high (>99.99%) and finding the rare phenotype Di (a+b-) is even more laborious than the search for Diª antigen. The frequency of Wrª and Wrb antigens in different populations is not well-known, but it is estimated that the prevalence is 0.01% and >99.99% respectively. 410 blood donor samples and 230 patient samples were used for genotyping in qPCR using DNA pool to detect the alleles DI*01, DI*01, DI*02.03 and DI*02.04. The single amplification was performed when the pool reaction demonstrated the amplification of one of the alleles of interest, DI*01 or DI*02.03. The alleles were also cloned after the control samples amplification. Only the cloning of the DI*02 and DI*02.03 alleles occurred, they presented excellent amplification and will be used as positive controls in future molecular tests, it was not possible to clone DI*01 by the control sample zygosity though. There was 100% agreement between the genotyping results and the phenotype information of the control samples. The DI*01 allele occurred in 0,6% of the blood donors and 1,7% in afrodescendants, which corresponds to a genotypic frequency DI*01/DI*02 of 1,2% and 1,3% in respectively. The comparative statistical analyzes between this research results and others in the Brazilian population on the different genotypes was performed to understand if there was a considerable statistical difference. Although the frequency of the genotype DI*01/DI*02 is lower in donors and higher in afrodescendants than that published in other Brazilian studies, data analysis showed that there was no statistical difference with most of them. The increased incidence of the DI*01 allele in the afrodescendant population demonstrates the aspect of miscegenation. It is concluded in this work that the proposed methodology works and has immediate applicability in the screening of blood donors and search for rare phenotypes. The incidence of the allele encoding Di ª antigen in blood donors is below than previously detected in Ribeirão Preto (COZAC, 2004), which can be explained by the differences in the population census between the studies and by the sample collection of university students (62%). The genotypes DI*01/DI*01, DI*02.03/DI*02.03 and DI*02.03/DI*02.04 were not found in the populations studied.
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