Presença da Caspase-3 ativa e das proteínas de reparo de lesões do DNA em embriões suínos ativados partenogeneticamente com alta ou baixa capacidade de desenvolvimento

Autor: Coutinho, Ana Rita Sousa
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2007
Předmět:
Druh dokumentu: Tese de Doutorado
Popis: Apoptose é uma forma de morte celular extremamente conservada que tem papel primordial no desenvolvimento animal e na homeostasia celular, agindo como mecanismo de controle de qualidade com a função de remover células danificadas, em excesso ou não-funcionais. Este processo tem papel importante no desenvolvimento embrionário pré-implantacional, pois as células embrionárias estão sujeitas aos danos no DNA que podem ativar mecanismos de reparo de DNA ou induzir apoptose, que culmina com a ativação da enzima caspase-3 responsável pela clivagem de vários substratos celulares. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivos determinar a presença da Caspase-3 ativa (+casp-3) e sua influência no desenvolvimento de embriões suínos no estágio de pré-implantação, bem como investigar a detecção de proteínas que atuam no mecanismo de lesão e reparo do DNA. Foram realizados 4 experimentos com oócitos imaturos de fêmeas pré-púberes, obtidos de ovários oriundos de abatedouro, maturados in vitro (MIV) por 44-46 horas. Oócitos em metáfase II (MII) foram ativados partenogeneticamente (AP) com ionomicina e cloreto de estrôncio e cultivados in vitro em PZM3 a 38ºC e 5% CO2 em ar e alta umidade. No primeiro experimento os embriões foram classificados em 4 grupos de acordo com o tempo de clivagem e o número de células: R4 - clivado às 24 horas e com ≥4 células às 48 horas; R2 - clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas; L4 - não clivado às 24 horas e com ≥4 células às 48 horas; L2 - não clivado às 24 horas e com 2 ou 3 células às 48 horas. Os embriões foram então avaliados no D-6 do CIV para determinação do índice de desenvolvimento até o estágio de blastocisto. Os embriões do grupo R apresentaram maiores índices de blastocisto, R4 - 66,1 (174/263) e R2 - 59,6 (62/104) e maior número de núcleos por blastocisto, R4 - 40,1 e R2 - 37,8, quando comparados ao grupo L, L4 - 15,4 (6/39) e L2-16,8 (13/77); L4-18,5 e L2-18,3 (Qui-quadrado e Tukey-Kramer, respectivamente, P
Apoptosis is a highly conserved form of cell death that plays a major role in animal development and cellular homeostasis by acting as a quality control mechanism to remove cells that are damaged, nonfunctional, misplaced or supranumerary. This form of cell death plays a major role on preimplantation embryonic development since embryonic cells are often subject to DNA damage, triggering either DNA damage and repair mechanisms or apoptosis. Once initiated the apoptotic process leads to caspase activation and cleavage of cellular substrates. The aim of the present study was to quantify active Caspase-3 (+casp-3) and to determine the role of this pro-apoptotic enzyme on the development of preimplantation porcine embryos, as well as to investigate the presence and localization of DNA damage and repair proteins. Four experiments were conducted using slaughterhouse immature oocytes collected from pre-pubertal gilt ovaries and in vitro matured (IVM) for 44-46 h. Metaphase II (MII) oocytes were parthenogenetically activated (PA) using ionomycin and strontium chloride and cultured in PZM-3 at 38ºC, 5% CO2 in air and high humidity. In the first study embryos were distributed into 4 groups according to cleavage time and cell number: R4 - cleaved at 24 h with ≥4-cells at 48 h; R2 - cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h; L4 - non-cleaved at 24 h with ≥4-cells at 48 h; L2 - non-cleaved at 24 h with 2-3 cells at 48 h. Group R embryos showed higher blastocyst rates R4-66.1 (174/263) and R2-59.6 (62/104) and more nuclei per blastocyst, R4-40.1 and R2-38.9, when compared to group L L4-15.4 (6/39) and L2-16.8 (13/77); L4-18.5 and L2-18.3 (Chi-square and Tukey-Kramer, P
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