Efeito da desmineralização óssea sobre parâmetros de superfície e sobre o comportamento de pré-osteoblastos em cultura: estudo em microscopia eletrônica de varredura e confocal

Autor: Salmeron, Samira
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2015
Předmět:
Druh dokumentu: Tese de Doutorado
Popis: A desmineralização óssea superficial tem se demonstrado favorável à consolidação de enxertos e ao comportamento celular, entretanto os mecanismos envolvidos ainda não estão esclarecidos. Os subsídios para o embasamento biológico da desmineralização, proporcionado por publicações anteriores, sugeriram que modificações na superfície óssea teriam influenciado o comportamento de pré-osteoblastos em cultura. Assim, este estudo objetivou comparar o efeito de duas concentrações de ácido cítrico na desmineralização de superfícies ósseas onde foram cultivadas células pré-osteoblásticas (MC3T3-E1), e analisar parâmetros de superfície comparando superfícies desmineralizadas a não desmineralizadas. Setenta amostras ósseas bicorticais foram removidas das calvárias de 35 ratos e divididas em grupos para as análises: 1) Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) para avaliação da área de recobrimento e espessura da camada de células sobre as amostras (n = 15) durante 24, 48 e 72 horas: Grupo AC.10 amostras desmineralizadas por 30 segundos com ácido cítrico 10 %; Grupo AC.50 amostras desmineralizadas por 30 segundos com ácido cítrico 50 %; e Grupo C (controle) amostras não desmineralizadas; 2) Microscopia Confocal para análise da área de expressão e intensidade de fluorescência das BMP-2, -4 e -7: AC.10 seis amostras desmineralizadas conforme item 1); AC.50 seis amostras desmineralizadas conforme item 1); C três amostras não desmineralizadas; 3) Microscopia Confocal para análise da rugosidade superficial média (Ra e Sa): Grupos AC.10 e AC.50 com cinco amostras cada, desmineralizadas conforme o item 1), sendo cada amostra seu próprio controle (análises antes e depois da desmineralização). Também foram avaliadas as distâncias entre picos (P-P) e entre picos e vales (P-V) antes e depois da desmineralização; 4) Microscopia Eletrônica de Varredura / Espectroscopia de Energia Dispersiva (MEV / EDS) para análise da composição superficial: mesmas amostras do item 3) foram avaliadas antes e depois da desmineralização quanto à porcentagem atômica (%A) de carbono, oxigênio, magnésio, fósforo, enxofre e cálcio. Análises estatísticas foram feitas adotando nível de significância de 95 %. Amostras desmineralizadas apresentaram células morfologicamente em estágios mais avançados de diferenciação do que as não desmineralizadas. A área de recobrimento superficial foi significantemente maior após 24 horas de cultura nos grupos teste do que no controle e a espessura da camada de células também foi maior nos grupos teste às 48 e 72 horas. Houve significantemente maior expressão de BMP-2 e -7 nos grupos teste do que no controle e, apenas AC.10 demonstrou maior expressão de BMP-4 do que os demais grupos, sem significância em relação a AC.50. Os parâmetros de superfície Ra e Sa foram inconclusivos, mas P-P e P-V diminuíram consideravelmente após a desmineralização para distâncias compatíveis com superfícies favoráveis à adesão e diferenciação celular. A análise da composição química superficial revelou diminuição da %A de enxofre e magnésio nos grupos teste. A concentração do ácido, embora não tenha apresentado diferença significante para a maioria das análises, pareceu ter influência positiva nos resultados para o ácido cítrico 10 %. Concluiu-se que a desmineralização superficial parece promover a proliferação e diferenciação celular, proporcionando superfícies com características de composição e topografia que favorecem o comportamento celular verificado.
The superficial bone demineralization has proved to be a favorable procedure for bone grafts consolidation and cell behavior, however the underlying mechanisms have not been clarified yet. Therefore, this study aimed to compare the effect of two concentrations of citric acid on demineralization of bone surfaces where pre-osteoblastic cells (MC3T3-E1) were cultivated, and analyze surface parameters comparing demineralized bone surfaces with non-demineralized surfaces. Seventy bicortical bone samples were harvested from the calvaria of 35 rats and divided into groups as follows: 1) Scanning Electron Microscopy (SEM) to evaluate the coating area and thickness of cells layers cultured on the samples (n = 15) for 24, 48, and 72 hours: Group CA.10 samples demineralized for 30 seconds with 10 % citric acid; Group CA.50 samples demineralized for 30 seconds with 50 % citric acid, and Group C (control) non-demineralized samples; 2) Confocal Microscopy for analysis of expression area and intensity of fluorescence of BMP-2, -4, and -7: CA.10 six samples demineralized as item 1); CA.50 six samples demineralized as item 1); Group C three non-demineralized samples; 3) Confocal Microscopy for surface mean roughness analysis (Ra and Sa): Groups CA.10 and CA.50 made up of five samples each and demineralized according to item 1), each sample was its own control (analysis before and after demineralization). The distances between peaks (P-P) and between peaks and valleys (P-V) were also evaluated before and after demineralization; 4) Scanning Electron Microscopy / Energy dispersive Spectroscopy (SEM / EDS) to analyze the surface composition: the same samples of item 3) were evaluated before and after demineralization for atomic percentage (%A) of carbon, oxygen, magnesium, phosphorus, sulfur and calcium. Statistical test was made by adopting the 95 % significance level. Demineralized samples showed cells with morphology in the later stages of differentiation than non-demineralized ones. The coating surface area by cells was significantly higher after 24 hours of culture in the test groups than in the control and the thickness of the layers were also greater in the test groups at 48 and 72 hours of evaluation. There was significantly higher expression of BMP-2 and -7 in test groups than in the control group, and only the CA.10 group showed higher BMP-4 expression than the other groups, but the difference was not statistically significant compared to the CA.50 group. Ra and Sa surface parameters were inconclusive, however P-P and P-V decreased considerably after demineralization to distances compatible with surfaces favorable to cell adhesion and cell differentiation. The chemical composition analysis of the surfaces revealed a decrease in the %A for sulfur and magnesium in test groups. Although the acid concentration did not shown significant difference for most analysis, it seemed to have a positive influence for the results with citric acid 10 %. It was concluded that the surface demineralization seems to promote cell proliferation and differentiation, providing surfaces with composition and topography that can favor observed cell behavior.
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