Laser Mikrodissektion als Tool für gewebespezifische Expressionsanalysen in Pflanzen: Methodik und Anwendung

Autor: Larisch, Christina
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2011
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Popis: Die Laser Mikrodissektion konnte in der vorliegenden Arbeit als geeignetes Tool für Expressionsanalysen pflanzlicher Gewebe weiterentwickelt werden. Nach einer umfangreichen Optimierung der Technik und Anpassung an die jeweiligen Gegebenheiten der zu analysierenden pflanzlichen Gewebe konnten unterschiedliche physiologische Fragestellungen an verschiedenen Pflanzen bearbeitet werden. Methodische Fortschritte Bei den Arbeiten an infiltrierten Arabidopsis-Pflanzen zeigten sich die methodischen Verbesserungen besonders deutlich: i. Die Zeit der Probengenerierung konnte um 60 80 % reduziert werden, wobei gleichzeitig die Qualität und Quantität der isolierten RNA erheblich verbessert wurden. ii. Dadurch konnte auf die in Deeken et al. (2008) beschriebene Voramplifikation, die stets zum Verlust niedrig exprimierter Gene führt, verzichtet und eine deutlich größere Zahl an im Phloem exprimierten Genen identifiziert werden. iii. Dass dabei 95 % der bei Deeken et al. beschriebenen Phloem-Gene wiedergefunden wurden, zeigt die hohe Reproduzierbarkeit der LMPC-Technik, die durch die Optimierung erreicht werden konnte. Pathogenantwort im Arabidopsis-Phloem iv. Die Laser Mikrodissektion konnte entsprechend i iii eingesetzt werden, um Phloem-Proben von Arabidopsis-Blütenstielen nach Pathogenbefall zu sammeln. v. Bei der Suche nach entsprechenden Phloem-mobilen Signalen, die in systemischen Geweben zur Auslösung der SAR führen, zeigte sich, dass im Phloem der Arabidopsis-Blütenstiele v. a. der Jasmonsäureweg angeschaltet wird. SAR-Marker fanden sich kaum induziert. vi. Im Vergleich der Mikroarray- und qPCR-Ergebnisse wird deutlich, dass mittels LMPC die Vorgänge im Phloem deutlich besser aufgelöst werden können, da die Untersuchungen an kompletten Blütenstielen deutliche Abweichungen gegenüber den Phloem-Arrays aufwiesen. Die Analysen der Mikroarrays sowie die zugehörigen Zeitreihenexperimente sind noch nicht abgeschlossen. Pappel-Holzstrahlen als Schaltstelle der saisonalen Umsteuerung vii. Die Laser Mikrodissektion kann alternativ auch in einem inversen Ansatz angewendet werden. viii. Über auf diese Weise angereicherte Holzstrahlen der Pappel war es möglich, tiefgreifende Einblicke in die Saisonalität der Pappel zu erlangen. ix. Zusammen mit Metabolit- und qPCR-Analysen lieferten diese Ergebnisse einen zeitlichen Ablaufplan der zugrundeliegenden physiologischen Prozesse, insbesondere bei der Umsteuerung von der Dormanz zur Wiederaufnahme des aktiven Wachstums im Frühjahr.
In this dissertation, the Laser Microdissection could be further improved for usage as an adequate tool for expression analyses of plant tissues. Following a large optimization of the technique itself and an adaptation to the conditions of the plant tissues to be analyzed, different physiological questions could be processed using distinct plant species. Methodic improvements Especially while working with infiltrated Arabidopsis plants the methodic improvements were visible: i. The time for sample-generation could be decreased by 60-80 %, at the same time quality and quantity of the isolated RNA could be significantly enhanced. ii. By this the in Deeken et al. (2008) described pre-amplification step, which always leads to loss of low expressed genes, could be omitted, and a considerable higher number of phloem-expressed genes could be identified. iii. Finding 95 % of the in Deeken et al. specified genes in the new list demonstrates the high reproducibility of the LMPC-technique which could be achieved by the optimization. Pathogen response in the Arabidopsis phloem iv. The Laser Microdissection could be used accordingly to i-iii to collect phloem-samples of Arabidopsis inflorescence stalks after a pathogen infection. v. By searching for corresponding phloem-mobile signals that lead to an induction of SAR in systemic tissues it appeared that predominantly the jasmonic acid pathway activated in the phloem of Arabidopsis inflorescence stalks. SAR-marker genes were hardly induced. vi. Comparison of the microarray- and qPCR-data revealed that LMPC shows the processes in the phloem more specific, because analyses of complete inflorescence stalks showed explicit differences to the phloem-microarrays. Analyses of the microarrays as well as the corresponding time course experiments are not yet completed. Poplar wood rays as switch point of seasonal remodeling vii. Alternatively, the Laser Microdissection can be used in an inverted approach. viii. By this approach enriched poplar wood rays allowed deep insight into seasonality of poplar. ix. Together with metabolite- and qPCR-analyses these results provided a timetable of underlying physiological processes, especially during the remodeling from dormancy to resumption of active growth in spring.
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