Isolation und Identifizierung von Photorezeptoren, Mikroglia und Müller Zellen der murinen Retina
| Autor: | Schmitt, Christian |
|---|---|
| Jazyk: | němčina |
| Rok vydání: | 2024 |
| Předmět: | |
| Druh dokumentu: | Doctoral Thesis<br />Doctoral Thesis |
| DOI: | 10.25972/OPUS-37579 |
| Popis: | Ziel dieser Arbeit war die Etablierung zweier Methoden zur Analyse und Isolation retinaler Zellen. Das Augenmerk wurde dabei auf Photorezeptoren, Mikroglia und Müller Zellen gelegt. Zur Darstellung der Spezifität der verwendeten Oberflächenmarker wurden diese auf retinalen Kryoschnitten eingesetzt und mittels Fluoreszenzmikroskop analysiert. Zur Analyse und Isolation von Zellen wurde zunächst ein Protokoll zur Herstellung einer Einzelzellsuspension etabliert, um im Anschluss mittels Durchflusszytometrie Photorezeptoren und Mikroglia Zellen als Zellpopulationen darzustellen und isolieren zu können. Weiterführend wurden Photorezeptoren und Mikroglia Zellen einer Mauslinie mit einer Deletion von Smad7 in retinalen Neuronen, Müller Zellen (Smad7∆oc Mäusen) sowie Photorezeptoren und Mikroglia Zellen der Kontrollgeschwistertiere isoliert und mittels qPCR ein signifikant geringeres Smad7 mRNA Expressionsniveau in den Smad7∆oc Photorezeptoren gezeigt. Problematisch gestaltete sich die Isolation von Müller Zellen sowohl mittels Durchflusszytometrie aber auch mittels magnetisch aktivierter Zellseparation. Diese Zellpopulation konnte in der vorliegenden Arbeit nicht erfolgreich isoliert werden. Weiterführende immunhistochemische Studien zeigten, dass der verwendete CD29 Antikörper, obwohl in der Literatur als zuverlässiger Müller-Zell-Marker beschrieben, eine starke Reaktivität mit Endothelzellen zeigt. Zusammenfassend konnte durch die Daten dieser Promotion ein Protokoll etabliert werden, um mittels Durchflusszytometrie sowohl die Analyse als auch die Isolation von Photorezeptoren und Mikroglia aus murinen Retinae zu ermöglichen und diese in weiterführenden Studien zu verwenden. The aim of this study was to establish two methods for the analysis and isolation of retinal cells, with a focus on photoreceptors, microglia, and Müller cells. To demonstrate the specificity of the surface markers used, they were applied to retinal cryosections and analyzed using fluorescence microscopy For cell analysis and isolation, a protocol for generating a single-cell suspension was first developed, allowing photoreceptors and microglia cells to be represented and isolated as cell populations via flow cytometry. Furthermore, photoreceptors and microglia cells from a mouse line with a deletion of Smad7 in retinal neurons and Müller cells (Smad7∆oc mice) as well as photoreceptors and microglia cells from control littermates were isolated. Using qPCR, a significantly lower Smad7 mRNA expression level was shown in the Smad7∆oc photoreceptors. The isolation of Müller cells proved challenging using both flow cytometry and magnetic-activated cell sorting. This cell population could not be successfully isolated in the present study. Further immunohistochemical studies showed that the CD29 antibody used, although described in the literature as a reliable Müller cell marker, showed strong reactivity with endothelial cells. In summary, this thesis established a protocol that enables both the analysis and isolation of photoreceptors and microglia from murine retinas via flow cytometry, providing a basis for further studies. |
| Databáze: | Networked Digital Library of Theses & Dissertations |
| Externí odkaz: |
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