Exploring novel virulence factors and regulators important for \(Campylobacter\) \(jejuni\) physiology

Autor: König, Fabian Christoph Reiner
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2024
Předmět:
Druh dokumentu: Doctoral Thesis<br />Doctoral Thesis
DOI: 10.25972/OPUS-34644
Popis: Enteric infections are widespread throughout the world and continue to pose a serious health threat, especially to younger children. Bacterial pathogens apply a plethora of distinct virulence mechanisms to efficiently infect and establish host colonization, consequently leading to various diseases. Campylobacter jejuni is currently the leading cause of bacterial foodborne diarrheal disease worldwide. However, in comparison to other enteric pathogens, relatively little is known about how this bacterium establishes infections and mediates virulence in humans. Its genome lacks classical virulence factors or toxins known from other enteric pathogens and only encodes three known sigma factors, suggesting additional layers of gene regulation. Recent transcriptome studies in C. jejuni confirmed the existence of several small regulatory RNAs (sRNAs). However, their function remains largely elusive. This thesis aimed to uncover novel regulators of C. jejuni virulence and physiology. Therefore, a dual RNA sequencing (dual RNA-seq) experiment was performed upon infection of Caco-2 cells in a recently advanced human intestinal three-dimensional (3D) infection model, in parallel to standard two-dimensional (2D) infection of monolayers. This deep-sequencing approach allows for the simultaneous quantification of host and pathogen transcriptomes on a global scale and was intended to unravel new bacterial host-adaptation and virulence-associated factors, as well as to assess host measures in response to C. jejuni infection. While only a small number of human genes were differentially regulated upon infection with C. jejuni NCTC11168 wild-type (WT) bacteria, a large proportion of bacterial genes were found to be differentially expressed. A closer look at the bacterial transcriptome post infection revealed little overlap between up- or downregulated genes in the 3D tissue model compared to 2D cell culture. In addition, different functional classes were enriched in adhered and internalized bacteria within these two different infection environments. Strikingly, several sRNAs were found to be upregulated during infection, highlighting their potential importance for host-pathogen interactions. In many bacterial species, sRNAs are involved in post-transcriptional regulation and fine-tuning of diverse fundamental processes including pathogenesis. Since their role in C. jejuni physiology was largely unexplored, candidates from the dual RNA-seq experiment were selected to uncover their putative targets and characterize their function in C. jejuni NCTC11168. Therefore, sRNA mutant strains were generated and tested for distinct phenotypic traits such as growth defects, protein expression, and motility in comparison to WT bacteria. Furthermore, growth-dependent differences in sRNA expression were determined and total RNA sequencing (RNA-seq) experiments with sRNA deletion mutants were performed to unravel their targetome, in combination with in-silico predictions. Since flagellar motility is a crucial virulence factor that allows Campylobacter to navigate through the viscous mucus of the human intestine, sRNA involvement in this process was explored in more detail. In contrast to transcriptional control of the hierarchically expressed flagellar components, little is known about post-transcriptional regulation of the flagellar biosynthesis cascade in C. jejuni. To this end, one sRNA (CJnc230), encoded downstream of the flagellar hook structural gene flgE and strongly upregulated after infection of the 3D tissue model, was selected to investigate a potential functional link to bacterial motility. CJnc230 is dependent on the flagellar sigma-54 factor (RpoN) and was found to be co-transcribed with the upstream gene flgE, requiring three distinct ribonucleases (RNases) for its processing and maturation. Termination site sequencing (term-seq) and differential RNA sequencing (dRNA-seq) techniques were used to further dissect CJnc230 biogenesis, revealing the boundaries of the most abundant CJnc230 fragment and the presence of an alternative transcriptional start site (TSS) originating from an independent promoter. RNA-seq was performed with an overexpression mutant of CJnc230 to decipher its biological function. In-vitro and in-vivo approaches confirmed direct interaction of the CJnc230 single-stranded region with the ribosome binding site (RBS) of Cj1387c (putative transcriptional regulator) and flgM (anti-sigma-28 factor) mRNAs, thereby repressing their translation. Phenotypic characterization further demonstrated that the CJnc230 overexpression mutant exhibits increased motility and flagellar filament length. The latter is most likely due to increased expression of the major flagellin flaA after repression of FlgM and indirect transcriptional activation of late flagellar genes, dependent on the flagellar sigma-28 factor (FliA). In contrast to CJnc230, the FliA-dependent sRNA CJnc170 was shown to decrease filament length and motility when overexpressed with a heterologous promoter. These observations suggest renaming CJnc230 and CJnc170 to FlmE and FlmR (flagellar length and motility enhancer/repressor), respectively, and that sRNA-mediated post-transcriptional regulation fine-tunes C. jejuni flagellar biosynthesis through balancing of the hierarchically expressed components. In summary, this thesis reveals the importance of C. jejuni sRNAs during infection and dissects the molecular targetome of selected candidates. Moreover, validation of target interactions and downstream functions uncovered a previously uncharacterized role for the CJnc230 sRNA in flagellar biogenesis and its effect on motility, a key determinant of C. jejuni virulence.
Infektionen des Gastrointestinaltrakts sind weltweit verbreitet und stellen nach wie vor eine Gesundheitsbedrohung, insbesondere für Kleinkinder, dar. Bakterielle Krankheitserreger nutzen eine Vielzahl unterschiedlicher Virulenzmechanismen, um den Wirt effizient zu infizieren und zu besiedeln, was zu verschiedenen Krankheiten führen kann. Campylobacter jejuni ist momentan die häufigste Ursache für über die Nahrung übertragene, bakterielle Durchfallerkrankungen weltweit. Im Vergleich zu anderen Darmpathogenen ist jedoch relativ wenig darüber bekannt, wie dieses Bakterium eine Infektion auslöst und welche Virulenzmechanismen diese beim Menschen vermitteln. Dem Genom von C. jejuni fehlen klassische Virulenzfaktoren oder Toxine, die von anderen Darmpathogenen bekannt sind, und es enthält nur drei bekannte Sigmafaktoren, was auf zusätzliche Ebenen der Genregulation schließen lässt. Jüngste Transkriptomstudien an C. jejuni bestätigten die Existenz mehrerer kleiner regulatorischer RNAs (sRNAs). Deren Funktion ist jedoch noch weitgehend ungeklärt. Ziel dieser Doktorarbeit war es, neue Regulatoren der Virulenz und Physiologie von C. jejuni aufzudecken. Dazu wurde ein duales RNA-Sequenzierungsverfahren (dual RNA-seq) nach Infektion von Caco-2-Zellen in einem kürzlich entwickelten dreidimensionalen (3D) Infektionsmodell des menschlichen Darms angewendet, parallel zu herkömmlichen Infektionen in zweidimensionaler (2D) Zellkultur. Diese Hochdurchsatz-Sequenziermethode ermöglicht die globale Quantifizierung des Transkriptoms von Wirt und Erreger in derselben Probe und sollte neue bakterielle Anpassungs- und Virulenzfaktoren aufdecken, sowie die Reaktion des Wirts auf die Infektion mit C. jejuni erfassen. Während nach der Infektion mit C. jejuni NCTC11168 Wildtyp (WT)-Bakterien nur wenige menschliche Gene dereguliert waren, wurde bei einem großen Teil des bakteriellen Transkriptoms eine veränderte Genexpression festgestellt. Ein genauerer Blick verriet, dass es nur wenige Überschneidungen zwischen hoch- und herunterregulierten bakteriellen Genen im 3D-Gewebemodell im Vergleich zu 2D-Zellkultur gab. Darüber hinaus waren, je nach Infektionsumgebung, verschiedene funktionelle Klassen von Genen unterschiedlich stark in adhärenten und internalisierten Bakterien repräsentiert. Auffallend war außerdem, dass mehrere sRNAs während der Infektion hochreguliert waren, was deren mögliche Bedeutung für die Interaktion zwischen Wirt und Erreger unterstreicht. In vielen Bakterienarten sind sRNAs an der post-transkriptionellen Regulierung und Feinabstimmung verschiedener grundlegender Prozesse beteiligt, unter anderem auch an der Pathogenese. Da ihre Rolle in der Physiologie von C. jejuni aber weitgehend unerforscht ist, wurden Kandidaten aus dem dualen RNA-seq Experiment ausgewählt, um mögliche Zielgene aufzudecken und ihre Funktion in C. jejuni NCTC11168 zu charakterisieren. Dazu wurden sRNA-Mutantenstämme erzeugt und auf unterschiedliche phänotypische Merkmale, wie Wachstumsdefekte, Proteinexpression und Motilität, im Vergleich zu WT-Bakterien getestet. Darüber hinaus wurden wachstumsabhängige Unterschiede in der sRNA-Expression bestimmt und RNA-Sequenzierungsexperimente (RNA-seq) mit den Deletionsmutanten durchgeführt, um deren Zielgen-Repertoire in Kombination mit in-silico Vorhersagen zu entschlüsseln. Da flagellare Motilität ein wichtiger Virulenzfaktor ist, der es Campylobacter ermöglicht, durch die zähflüssige Mukusschicht des menschlichen Darms zu navigieren, wurde die Beteiligung von sRNAs an diesem Prozess genauer untersucht. Im Gegensatz zur hierarchisch geordneten Transkription der einzelnen Komponenten der bakteriellen Geißel, ist über die post-transkriptionelle Regulation der Flagellen-Biosynthese in C. jejuni nur wenig bekannt. Daher wurde eine sRNA (CJnc230) ausgewählt, die hinter dem Strukturgen flgE (flagellarer Haken) liegt und nach Infektion des 3D-Gewebemodells stark hochreguliert war, um eine mögliche funktionelle Verbindung zur bakteriellen Motilität zu untersuchen. CJnc230 ist abhängig vom alternativen Sigmafaktor RpoN (Sigma 54) und wird zusammen mit dem vorgelagerten Gen flgE transkribiert, wobei drei verschiedene Ribonukleasen (RNasen) für die Prozessierung und Reifung erforderlich sind. Mit Hilfe von termination site sequencing (term-seq) und differential RNA sequencing (dRNA-seq) wurde die Biogenese von CJnc230 weiter aufgeschlüsselt. Dabei wurden die Enden des am häufigsten vorkommenden CJnc230-Fragments und die Existenz einer alternativen Transkriptionsstartstelle (TSS), die von einem unabhängigen Promotor stammt, aufgedeckt. Um die biologische Funktion von CJnc230 zu entschlüsseln, wurde RNA-seq mit einer Überexpressionsmutante der sRNA durchgeführt. In-vitro und in-vivo Ansätze bestätigten die direkte Interaktion der einzelsträngigen Region von CJnc230 mit der Ribosomenbindestelle (RBS) der mRNAs von Cj1387c (potenzieller Transkriptionsfaktor) und flgM (anti-Sigma-28-Faktor), wodurch die Translation unterdrückt wird. Die phänotypische Charakterisierung zeigte außerdem, dass die CJnc230-Überexpressionsmutante eine erhöhte Motilität und Länge des Geißelfilaments aufweist. Letzteres ist höchstwahrscheinlich auf eine verstärkte Expression des Hauptflagellins flaA nach Repression von FlgM und eine indirekte transkriptionelle Aktivierung von späten flagellaren Genen, die vom alternativen Sigmafaktor FliA (Sigma 28) abhängig sind, zurückzuführen. Im Kontrast zu CJnc230 wurde gezeigt, dass die FliA-abhängige sRNA CJnc170 die Filamentlänge und Motilität verringert, wenn sie mit einem heterologen Promotor überexprimiert wird. Diese Beobachtungen legen eine Umbenennung von CJnc230 und CJnc170 in FlmE bzw. FlmR (flagellar length and motility enhancer/repressor) nahe und zeigen, dass die Flagellen-Biosynthese in C. jejuni zusätzlich durch sRNA-vermittelte, post-transkriptionelle Feinabstimmung der hierarchisch exprimierten Komponenten im Gleichgewicht gehalten wird. Zusammenfassend zeigt diese Doktorarbeit die Bedeutung von C. jejuni sRNAs während der Infektion auf und entschlüsselt die Zielgene ausgewählter Kandidaten. Darüber hinaus wurde durch die Validierung von sRNA-mRNA Interaktionen und nachgeschalteten Funktionen eine bisher nicht charakterisierte Rolle für die CJnc230 sRNA in der Flagellen-Biogenese und ihre Auswirkung auf die Motilität, ein Hauptmerkmal der Virulenz von C. jejuni, aufgedeckt.
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