Charakterisierung von AML-Antigenen mit fehlender Expression auf normalen hämatopoetischen Stammzellen für CAR-T-Zell-Therapien

Autor: Maucher, Marius
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2024
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Druh dokumentu: Doctoral Thesis<br />Doctoral Thesis
DOI: 10.25972/OPUS-28927
Popis: Die vergangenen Jahre haben eindrucksvoll gezeigt, dass CD19 und BCMA chimäre Antigen-Rezeptor (CAR)-T-Zell-Therapien nicht nur das Potential haben, die progres¬si-ons¬freie Überlebenszeit von Patienten mit hämatologischen Neoplasien zu verlängern, sondern auch diese erkrankten Menschen in einigen Fällen dauerhaft zu heilen. Trotz der noch immer bestehenden großen Herausforderung CAR-T-Zell-Therapien für mehr Tumorentitäten verfügbar zu machen, insbesondere was die Bekämpfung solider Tumore betrifft, haben die Entdeckung neuer Tumorantigene und Checkpoint-Inhibitoren in den letzten Jahren dazu beigetragen, dass sich immuntherapeutische Ansätze, insbesondere die der adoptiven Immunzelltherapie stetig weiterentwickeln konnten. Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine heterogene maligne Bluterkrankung mit schlechten Überlebens¬prognosen und die am häufigsten auftretende Leukämieform bei Erwachsenen. AML ist somit eine der hämatologischen Krebserkrankungen, die noch immer dringend medizini¬sche Innovation benötigt. CAR-T-Zell-Therapien gelten als attraktive neue Strategie, um AML zu bekämpfen, da die leukämischen Blasten empfindlich für T-Zell-vermittelte Lyse sind. In dieser Studie stellen wir Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin (Siglec) 6 als neues Zielmolekül für CAR-T-Zell-Therapien in AML vor. Wir entwickelten einen Siglec 6-spezifischen CAR mit einer vom humanen monoklonalen Antikörper JML 1 abgeleiteten Antigen-bindenden Domäne. Unsere Untersuchungen ergaben, dass Siglec 6 auf AML-Zelllinien als auch primären AML-Blasten sowie leukämischen Stamm¬zellen (LSCs) detektierbar ist. Die Behandlung mit Siglec 6 CAR-T-Zellen vermittelte eine anti-leukämische Reaktivität, die mit der Siglec 6-Expressionsstärke in präklinischen Modellen korrelierte. So bewirkten Siglec 6 CAR-T-Zellen eine komplette Remission in einem Xenograft-AML-Modell mit immundefizienten Mäusen und Tumorzellen mit hoher Siglec 6-Expression (NSG/U937). Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass Siglec 6 nicht auf gesunden hämatopoetischen Stamm(vor)läuferzellen (HSC/Ps) exprimiert wird. Unsere Daten legen damit nahe, dass die Siglec 6 CAR-T-Zell-Therapie zur AML-Behandlung eingesetzt werden kann, ohne dass eine nachfolgende hämatopoetische Stammzelltransplantation notwendig wird. In gesunden Blutzellen detektierten wir Siglec 6 auf einer Fraktion naiver B-Zellen und B-Gedächtniszellen sowie basophiler Gra¬nulozyten, sodass insgesamt mit einer limitierten On-Target Off-Tumor-Reaktivität ge¬rechnet werden kann. Die fehlende Siglec 6-Expression auf gesunden HSC/Ps ist ein sig¬nifikantes Unterscheidungsmerkmal zur Expression anderer zuvor untersuchter AML-CAR-Antigene wie CD33 oder CD123. Auch CD70 wird von HSC/Ps nicht exprimiert und wurde in dieser Studie als möglicher Kombinationspartner für duales Targeting in AML evaluiert. Dabei konnten wir feststellen, dass mehrheitlich mindestens eines der beiden CAR-Antigene, Siglec 6 oder CD70, von AML-Zelllinien und primären AML-Zellen expri¬miert wird. Ebenso ließ sich experimentell bestätigen, dass Siglec 6 CAR-T-Zellen mit JML 1-single chain variable fragment (scFv) und jeweils optimierten CAR-Spacersequen¬zen, keine signifikanten Funktionalitätsunter¬schiede aufweisen. Die Vorbehandlung von AML-Zellen mit Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitoren konnte die zytolytische Aktivität der Siglec 6 CAR-T-Zellen durch Steigerung der Siglec 6-Oberflächenexpression auf den Targetzellen erhöhen. Sowohl Siglec 6 als auch CD70 CAR-T-Zellen konnten erfolgreich mit virusfreiem Gentransfer hergestellt werden, wobei die getesteten CD70 CAR-Kon¬strukte aufgrund der CD70-Expression aktivierter T-Zellen zu Fratricide führten und die CAR-Antigen-abhängige als auch unabhängige Proliferation der CD70 CAR-T-Zellen limitierte. Zusammengefasst zeigt diese Studie, dass sowohl Siglec 6 als auch CD70 hilf¬reiche Targetantigene zur CAR-T-Zellbehandlung der AML sein können und dass eine klinische Überprüfung, insbesondere von Siglec 6 CAR-T-Zellprodukten, gewährleistet ist.
In recent years, it could be impressively demonstrated that CD19 and BCMA chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies not only have the potential of prolonging progression-free and overall survival of patients with hematological malignancies, but in many cases are even able to cure them. Despite major challenges still hampering the broad applicability of CAR T-cells therapies, especially in the combat against solid tumors, the discoveries of novel tumor antigens and checkpoint inhibitors in past years have contributed to the steady development of immunotherapeutic approaches particularly those of adoptive immune cell therapy. Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous malignant blood disorder with poor survival prognosis that accounts for the most common form of leukemia in adults. Hence, AML is still one of the hematologic cancers with high unmet medical need. CAR T-cell therapies are considered an attractive new strategy to tackle AML as leukemic blasts are susceptible to T-cell-mediated lysis. In this study, we introduce sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin (Siglec)-6 as a novel target for CAR T-cell treatment in AML. We developed a Siglec-6-specific CAR with an antigen-binding domain derived from the human monoclonal antibody JML-1. Our studies revealed that Siglec-6 is detectable on AML cell lines as well as primary AML blasts and leukemic stem cells (LSCs). Siglec-6 CAR T-cell treatment conferred anti-leukemic reactivity that correlated with Siglec-6 expression levels in preclinical models. Thus, Siglec-6 CAR T-cells induced complete remission in a xenograft AML model with immunodeficient mice and engrafted tumor cells with high Siglec-6 expression (NSG/U937). Furthermore, we observed that Siglec-6 is not expressed on healthy hematopoietic stem/precursor cells (HSC/Ps). Our data suggest that Siglec-6 CAR T-cell therapy can be effectively used for AML treatment without the need for subsequent hematopoietic stem cell transplantation. In healthy blood cells, we detected Siglec-6 on a fraction of naïve and memory B cells as well as on basophilic granulocytes, therefore overall on-target off-tumor reactivity may be expected to be limited. The lack of Siglec-6 expression on healthy HSC/Ps is a significant distinctive feature from the expression of other previously studied AML CAR antigens e.g. CD33 or CD123. Also, CD70 is not expressed by HSC/Ps and was evaluated in this study as potential combination partner for dual targeting in AML. We found that the majority of AML cell lines and primary AML cells are expressing at least one of the two antigens, either Siglec-6 or CD70. We also confirmed that Siglec-6 CAR T-cells with JML-1-single chain variable fragment (scFv) and two optimized CAR spacer sequences did not show significant differences in function. Pretreatment of AML cells with histone deacetylase (HDAC) inhibitors could augment cytolytic activity of Siglec-6 CAR T-cells by increasing Siglec-6 surface expression on AML target cells. Both, Siglec-6 and CD70 CAR T-cells were successfully manufactured via non-viral gene transfer, whereby tested CD70 CAR constructs induced fratricide due to CD70 expression of activated T-cells resulting in limited CAR antigen-dependent as well as antigen-independent proliferation of CD70 CAR T-cells. In summary, this study suggests that Siglec-6 as well as CD70 may be useful target antigens for CAR T-cell treatment of AML and warrants clinical investigation of Siglec-6 CAR T-cells in particular.
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