Monocouches peptidiques auto-assemblées et applications dans le domaine des biocapteurs de résonance de plasmon de surfaces

Autor: Bolduc, Olivier R.
Jazyk: francouzština
Rok vydání: 2011
Předmět:
Druh dokumentu: Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation
Popis: Ces travaux visent à étendre les applications de la résonance de plasmons de surface (SPR) L’objectif est d’offrir des outils diagnostics plus rapides, efficaces et simple d’utilisation pour diagnostiquer ou effectuer le suivi de conditions cliniques. Pour se faire, un nouveau type d’instrumentation SPR basé sur l’utilisation d’un prisme d’inversion (dove) a permis d’atteindre une limite de détection (LOD) de 10-6 unité d’indice de réfraction (RIU), une valeur comparable aux instruments commerciaux complexes tout en demeurant peu dispendieux, robuste et simple d’utilisation. Les travaux présentés dans cet ouvrage visent, dans un second temps, à réduire les interactions nonspécifiques (NSB) entre la surface des biocapteurs SPR et les composants de la matrice biologique complexe telles que: l’urine, le lysat cellulaire, le sérum et le sang. Ces dernières induisent des réponses empêchant l’utilisation de biocapteurs SPR en milieux complexes. Les acides aminés (AA) offrent une grande variété de propriétés physico-chimiques permettant la mise au point de monocouches auto-assemblées (SAM) aux propriétés diverses. Initialement, 19 des 20 acides aminés naturels ont été attachés à l’acide 3-mercaptopropionique (3-MPA) formant des SAMs peptidomimétiques. La quantité d’interactions nonspécifiques engendrées par ces différentes surfaces a été mesurée en exposant ces surfaces au sérum sanguin bovin complet variant de 400 ng/cm² jusqu’à 800 ng/cm². La détection à l’aide de ces surfaces de la β-lactamase (une enzyme responsable de la résistance aux antibiotiques au niveau μM) a démontré la possibilité d’employer ces surfaces pour bâtir des biocapteurs SPR. Des peptides de longueur allant de 2 à 5 résidus attachés à 3-MPA ont été synthétisés sur support solide. Cette étude a démontré que l’augmentation de la longueur des peptides formés d’AA résistants aux NBS accroit leur résistance jusqu’à 5 résidus. Le composé le plus performant de ce type (3-MPA-(Ser)5-OH) a permis d’atteindre 180 ng/cm². Cette valeur est similaire à celle des meilleures surfaces disponibles commercialement, notamment les surfaces de polyethylène glycol (PEG) à 100 ng/cm². Des surfaces de 3-MPA-(Ser)5-OH ont permis l’étalonnage de la β-lactamase et sa quantification directe dans un lysat cellulaire. La LOD pour ces biocapteurs est de 10 nM. Une troisième génération de surfaces peptidiques binaires a permis la réduction de la NSB jusqu’à un niveau de 23±10 ng/cm² une valeur comparable aux meilleures surfaces disponibles. Ces surfaces ont permis l’étalonnage d’un indicateur potentiel du cancer la metalloprotéinase-3 de matrice (MMP-3). Les surfaces formées de peptides binaires (3-MPA-H3D2-OH) ont permis la quantification directe de la MMP-3 dans le sérum sanguin complet. Une quatrième génération de surfaces peptidiques a permis de réduire davantage le niveau de NSB jusqu’à une valeur de 12 ± 11 ng/cm². Ces surfaces ont été modifiées en y attachant une terminaison de type acide nitriloacétique (NTA) afin d’y attacher des biomolécules marquées par six résidus histidines terminaux. Ces surfaces ont permis le développement d’une méthode rapide de balayage des ligands ciblant le « cluster of differenciation-36 » (CD36). L’étude d’électroformation des monocouches de peptide a permis de déterminer les conditions de formation optimales d’une couche de 3-MPA-HHHDD-OH permettant ainsi la formation de monocouches résistantes au NSB en moins de 6 minutes en appliquant un potentiel de formation de 200mV vs Ag/AgCl.
The work presented in this thesis aims to extend the use of surface plasmon resonance (SPR) biosensors to generate more rapid, cost efficient and simple to use diagnostic tools to diagnose or follow serious medical conditions. This task required the development of a new SPR instrument that relies on an inversion prism (dove) and is able to reach a limit of detection (LOD) in the 10-6 refractive index unit (RIU) range, a value comparable to more complex commercial instruments. The developed SPR instrumentation is inexpensive, robust and very simple to manipulate. The other work presented in this thesis is based on reducing nonspecific interactions between the surface of SPR sensors and components in biological matrices such as urine, cell lysate, serum and whole blood. These nonspecific interactions induce SPR responses that have typically prohibited the use of SPR in these complex matrices. Amino acidshavebeen investigated for reduction of nonspecific binding (NSB) because they offer a wide variety of physico-chemical properties capable of tuning the physical properties of surfaces in a self-assembled monolayer (SAM) format. Initially, the attachment of one of 19 physiological 20 amino acids to 3-mercaptopropionic acid (3-MPA) allowed the formation of amino acid SAMs. Exposure of these surfaces to bovine serum revealed nonspecific interactions ranging from 400 ng/cm² to 800 ng/cm². Detection assays for β-lactamase (an enzyme produced by drug resistant bacteria at a micromolar level) demonstrated that the amino acid SAM is suitable for SPR biosensing. By using a solid phase approach, peptides were of 2 to 5 residues were synthesized to investigate NSB properties. The result of this study showed that adding amino acids decreased nonspecific interactions up to a peptide length of 5 amino acids. The best performing peptide, 3-MPA-(Serine)5-OH, resulted in low nonspecific adsorption of bovine serum proteins to a level of 180 ng/cm². This value is similar to nonspecific adsorption obtained under identical conditions for one of the best reported surfaces: polyethylene glycol-based SAMs at 100 ng/cm². The 3-MPA-(Serine)5-OH based SAM was used to calibrate β-lactamase, leading to its direct quantification in crude cell lysate. The detection limit for this analyte was 10 nM. A third generation of peptide, which is binary patterned, decreased significantly nonspecific adsorption to a level as low as 23 ± 10 ng/cm², a value comparable to the best surfaces known. This surface SAM allowed the calibration of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), a potential indicator of cancer. Direct quantification assays of MMP-3 in whole blood serum were achieved with the binary patterned peptides developed. The LOD for MMP-3 was 0.2nM over a 50 nM linear domain. A fourth generation of peptide based surfaces was developed, reducing the level of nonspecific adsorption of blood serum proteins to 12 ± 11 ng/cm2. These new surfaces were modified to attach His-tagged biomolecules enabling rapid screening of small ligands targeting the Cluster of differentiation-36 (CD36). Finally, the electroformation of peptide monolayers was studied to determine the optimal conditions needed to form an ultralow biofouling surface. It was demonstrated that the difference in potential applied during the formation of a peptide based layer influences the kinetics of formation and the arrangement of this layer. An optimal layer of 3-MPA-HHHDD-OH could be obtained in less than 6 min by applying a potential of 200mV vs Ag/AgCl to the SPR sensor.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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