Caractérisation structurale et fonctionnelle d'une nouvelle interaction entre les protéines RPAP3 et TRBP

Autor: Abel, Yoann
Jazyk: francouzština
Rok vydání: 2016
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Popis: Récemment, plusieurs études ont permis de mettre en évidence un lien possible entre la maturation des snoARN et celle des microARN, deux familles d’ARNnc impliquées respectivement dans la maturation d’autres ARN, tels les ARNr, et dans la régulation de l’expression des gènes. En effet, ces études ont montré que certains microARN pouvaient être issus de la maturation d’un snoARN précurseur, formant alors une nouvelle classe d’ARNnc, les sdARN (ARN dérivés de snoARN). Le manque d’informations disponibles sur les mécanismes de maturation possibles des sdARN nous a conduit à réaliser un crible double-hybride chez la levure S. cerevisiae entre différentes protéines impliquées dans la biogenèse des snoARN et des microARN. Ce crible a permis d’identifier une nouvelle interaction entre les protéines TRBP, impliquée dans la maturation du pré-microARN en microARN, et RPAP3, un protéine du complexe d’assemblage hR2TP. L’observation de cette interaction soulève plusieurs questions, telles que son implication possible dans la maturation de microARN à partir de snoARN précurseurs, ou encore sur l’implication possible de TRBP et RPAP3 dans la biogenèse des snoRNP ou des microARN, respectivement. Nous avons alors entrepris de caractériser l’interaction entre TRBP et RPAP3. Par des approches de biologie moléculaire, de biochimie et de biologie structurale, nous avons d’une part confirmé l’existence du complexe in vitro et in vivo et identifié les domaines respectifs de TRBP et de RPAP3 impliqués dans l’interaction, ainsi qu’identifié plusieurs mutations intéressantes au niveau de l’interface d’interaction. L’utilisation de ces mutants devrait nous permettre d’étudier l’effet de la perte d’interaction entre TRBP et RPAP3 sur la maturation de différents ARNnc. Enfin, nos travaux ont également permis d’observer que l’interaction entre TRBP et RPAP3 n’était pas compatible avec la formation du complexe entre TRBP et la RNase Dicer. Or, il avait été montré que l’absence de TRBP au niveau de Dicer entraînait dans certains cas la génération de microARN avec des extrémités, et donc des spécificités, altérées (iso-miRs). La formation d’un complexe entre les protéines TRBP et RPAP3 pourrait donc constituer un moyen possible de réguler la disponibilité de TRBP et, indirectement, l’activité de Dicer
Recently, several studies have described a possible link between snoRNA and microRNA maturation, two ncRNA families involved in the maturation of other RNAs, such as rRNA, and in the regulation of gene expression, respectively. Indeed, these studies have shown that some microRNAs could be maturated from a snoRNA precursor, forming a new class of ncRNAs, the sdRNAs (snoRNA-derived RNAs). The mechanism of sdRNA maturation are still poorly understood. Therefore, we have performed a two-hybrid screen in the yeast S. cerevisiae between different proteins involved in microRNAs and snoRNAs biogenesis. Interestingly, we observed a novel interaction between TRBP, involved in the maturation of microRNAs, and RPAP3, a member of the hR2TP complex. The observation of this interaction raises several questions, such as its possible involvement in the maturation of microRNAs from snoARN precursors, or on the possible involvement of TRBP or RPAP3 in snoRNP or microRNA biogenesis, respectively. Using various molecular biology and biochemical approaches, we undertook the functional and structural characterization of the TRBP/RPAP3 interaction. First, we confirmed the interaction both in vitro and in vivo and we identified the TRBP and RPAP3 domains involved in the interaction, as well as several interesting mutations in the binding interface. Using these mutants should allow us to study the effects of this mutations on the maturation of differents ncRNAs. Additionally, we showed that the interaction between TRBP and RPAP3 and between TRBP and the RNase Dicer were mutually exclusive. Interestingly, it was shown that in the absence of TRBP, Dicer processig resulted, in some cases, in the generation of microRNAs with different ends, and thus, with altered specificity(iso-miRs). The interaction between TRBP and RPAP3 could therefore also constitute a possible way to regulate the availability of TRBP, and eventually the activity of Dicer
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