Etude structurale du mécanisme d'échange de chaînes des dimères de la protéine HU d'E. coli

Autor: Le Meur, Rémy
Jazyk: English<br />French
Rok vydání: 2015
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Popis: HU est une protéine bactérienne de type histone impliquée dans de nombreuses fonctions biologiques telles que la compaction, la transcription, la réplication et la réparation de l'ADN. Chez E. coli, il existe trois espèces dimériques de HU (HUα2, HUβ2 et HUαβ) ayant des rôles biologiques distincts. La formation de l'hétérodimère repose sur un échange de chaines peptidiques entre les homodimères. Un mécanisme modèle a été proposé par Ramstein et collaborateurs (J.M.B. 331, 101-121 2003) et a servi de point de départ a ce travail. Dans ce modèle, les homodimères transitent d'une conformation native (N2) vers une conformation intermédiaire (I2). Les homodimères sous forme I2 s'associent ensuite dans un hétérotetramère transitoire qui se redissocie en formant des hétérodimères. L'objectif principal de ce travail de thèse a été de caractériser chaque étape du mécanisme d'échange du point de vue structural et cinétique. Parmi les principaux résultats de ce travail, deux structures originales, HUβ2 de E. coli et HU de L. lactis, ont été obtenues par diffraction des rayons X et complètent la caractérisation structurale des protéines HU sous leur forme N2. Un modèle de la conformation I2, partiellement désordonnée, a été élaboré à partir des résultats obtenus en RMN et en simulation de dynamique moléculaire. De plus, l'existence de la conformation tétramérique a été mise en évidence en faible concentration par spectrométrie de masse en conditions natives. Des protocoles de production/purification/oxydation ont été mis au point pour l'introduction de ponts disulfure afin de stabiliser la conformation tétramérique en vue de sa caractérisation structurale. L'ensemble des données acquises par ces différentes méthodes biophysiques affine la compréhension du mécanisme d'échange de chaines d'un point de vue structural et cinétique et met en lumière le rôle clef de la conformation I2 dans le contrôle de la composition des dimères de HU.
HU is a histone like protein of bacteria involved in numerous biological functions such as DNA compaction, transcription, replication and repair. In E. coli, three HU dimers types are present (HUα2, HUβ2 et HUαβ) and show distinct biological roles. The heterodimer is formed from homodimers through a peptidic chain exchange. A model of this mechanism has been proposed by Ramstein and coworkers (J.M.B. 331, 101-121 2003) and was used as a starting point for this study. In this model, homodimers undergo a conformationnal change from a native state (N2) toward an intermediate state (I2). Then, I2 homodimers associate to form a transient heterotetramer which then dissociate into heterodimers. The main aim of this work was to characterize the structure and kinetic of each step of this mechanism. Major results of this work include the elucidation of two original crystal structures : HUβ2 from E. coli and HU from L. lactis in N2 states. A model of the partially disordered I2 state has also been proposed for HUβ2 and HUα2, and is consistent with results obtained from both NMR and molecular dynamics experiments. In addition, the existence of a low concentration tetrameric conformation has been evidenced by native mass spectrometry experiments. A protocol of production/purification/oxydation as been developped for the introduction of disulfide bridges in order to stabilize this conformation and characterize its structure. Together, results obtained from these different biophysical means refine our understanding of the chain exchange mechanism at the molecular level and highlight the role of the I2 conformation in controlling HU dimers composition.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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