Développement de stratégies de marquage isotopique des groupements méthyles pour l'étude d'assemblages protéiques de grande taille par RMN

Autor: Kerfah, Rime
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2014
Předmět:
Druh dokumentu: Text
Popis: Durant longtemps la spectroscopie RMN en solution a été limitée à de petits objets biologiques. Aujourd'hui, il est clairement reconnu que la stratégie du marquage isotopique spécifique de groupements méthyle dans une protéine perdeutérée a considérablement repoussé la frontière de cette technique. En effet, des protéines aussi grande que 1 MDa ont pu être récemment étudiées par RMN. Cependant, cette stratégie présente un inconvénient important lié au nombre réduit de sondes protonées. Dans ce contexte, le projet de thèse vise a développer de nouvelles méthodes pour faire face à cette rareté d'information structurale, en s'appuyant sur le marquage simultané (combinatoire) de plusieurs groupements méthyle afin d'augmenter le nombre de sondes. Pour un marquage combinatoire optimal, le choix des acides aminés à marquer et les précurseurs à utiliser ainsi que le protocole de leur incorporation doit être judicieusement étudié. Dans le présent travail, un nouveau protocole a été mis en place pour un marquage AbId1(LV)proS optimisé, exempt de toutes fuites isotopiques. En comparaison avec le marquage “AbId1LV standard", le modèle proposé permet la diminution d'un facteur de 2 le nombre de signaux RMN des Leu et Val et améliore par un facteur de 4 l'intensité des nOes à long portée qui sont expérimentalement détectable. Par ailleurs, ce protocole permet également la suppression des corrélations parasites, particulièrement nocives pour les études structurales basées sur la détection / analyse de nOes. Afin d'exploiter les spectres RMN obtenus en utilisant le protocole ci-dessus mentionné, l'attribution des signaux des méthyles est obligatoire. Deux stratégies ont été donc proposées. La première s'applique aux systèmes dont le poids moléculaire ne dépasse pas les 100 kDa (e.g. MSG). Elle se repose sur la linéarisation du marquage isotopique des acides aminés permettant ainsi l'utilisation de l'expérience 13C-TOCSY pour attribuer de manière régio et stéréo-spécifique les méthyles de l'isoleucine, leucine et valine en une seule étape. En ce qui concerne la seconde, adaptée aux protéines supra-moléculaire (> 100 kDa), c'est une optimisation de l'approche SeSAM (Sequence-Specific Assignment of Methyl groups by Mutagenesis) précédemment décrite dans la littérature. En effet, grâce au milieu de culture enrichi, mit au point pour le marquage spécifique de l'Ala, le volume minimal de culture requis a été considérablement diminué. Ceci a permis par conséquence de produire les protéines dans des plaques de 24 puits et de les purifier dans des plaques de 96 puits, raccourcissant ainsi le temps global de préparation des échantillons. Il a été estimé que l'utilisation de cette version améliorée de SeSAM offre la possibilité d'attribuer environ 100 méthyles en 2 semaines, dont 4 jours de temps de RMN, en consommant moins de 2 k € de matériaux isotopiques. Pour illustrer la pertinence du marquage isotopique et la protonation sélectifs des méthyles, de façon combinée ou pas, de nombreuses applications ont été présentés, à savoir l'étude en temps réel des processus d'auto-assemblage d'une protéine supramoléculaire (PhTET-2, ~ 0,5 MDa) par RMN. Le marquage combinatoire des protéines (82 kDa et 0,5 MDa) pour la détection de nOes longue portée (jusqu'à 10 Å et 8 Å respectivement) a également été étudié. Cette même approche a également été utilisée pour le filtrage de nOes inter-monomères à long portée, qui sont particulièrement importants pour le calcul de structure, dans des systèmes symétrique et homo-oligomèriques (PhTET-2).
Solution NMR spectroscopy has been limited to small biological objects for a long time. Nowadays, it is unequivocally recognized that the strategy of specific isotope labeling of methyl groups in a perdeuterated protein has significantly extended the frontier of this technique. Indeed, proteins as large as 1 MDa could be investigated by NMR. Conversely, this strategy presents an important drawback consisting of the drastically reduced number of protonated probes. The project of this thesis falls within the framework of developing new methodologies to cope with this scarce structural information, relying on the simultaneous labeling of several methyl groups to increase the number of probes. For optimized combinatorial labeling, the choice of the ensemble of amino acids to label simultaneously and the precursors as well as the protocol for their incorporation have to be carefully studied. In this work, a new protocol was introduced for the scrambling-free and optimized isotopic labeling of AbId1(LV)proS methyl groups. In comparison to the “standard AbId1LV” labeling scheme, the proposed pattern induces a 2-fold decrease of number of Leu and Val NMR signals and enhances the intensity of detectable long-range nOes by a factor 4. The described protocol also permits the suppression of spurious correlations, especially harmful for structural studies based on detection/analysis of nOes. To make an efficient use of the obtained high quality NMR spectra using this protocol, assignment of the methyl groups signals is mandatory. Two strategies were then proposed. The first is suitable for systems whose molecular weight does not exceed 100 kDa. It relies on the use of isotopically linearized precursors (with different isotope topologies to discriminate each methyl group) to assign in a regio- and stereo-specific manner the isoleucine, leucine and valine methyl groups in a single step, employing an optimized “out and back” 13C-TOCSY pulse sequence. While the second, adapted to supra-molecular proteins (> 100 kDa), consists of optimizing the previously reported SeSAM approach (Sequence-Specific Assignment of Methyl groups by Mutagenesis). Indeed, thanks to the developed enriched culture medium for the specific labeling of Ala, the minimal required culture volume was significantly decreased, enabling the proteins expression in 24 well plates and their parallel purification in 96 well plates. This improved SeSAM version was estimated to allow the assignment of ca. 100 methyl cross-peaks in 2 weeks, including 4 days of NMR time and less than 2 k€ of isotopic materials. To illustrate the pertinence of using selectively protonated methyl groups, either in a single or combined fashion, several applications were presented, namely the real-time NMR study of self-assembly process of a ~0.5 MDa supra-molecular protein (PhTET-2). The use of combinatorial labeling for the detection of long-range nOes to up to 10 Å (8 Å) in proteins of 82 kDa (respectively 0.5 MDa) was also investigated. This same approach was exploited for the filtering of inter-monomeric long-range nOes in the same symmetrical and homo-oligomeric PhTET-2 protein.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
Externí odkaz: