Human δ opioid receptor Phe27 and Cys27 variants:the role of heteromerization and pharmacological chaperones in receptor processing and trafficking

Autor: Leskelä, T. (Tarja)
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2011
Předmět:
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: The opioid receptors (δ, κ and μ) are family A G protein-coupled receptors (GPCRs) that have an important role in the regulation of pain. Like all GPCRs they have a common structure that consists of seven transmembrane domains with an extracellular amino (N)-terminus and an intracellular carboxyl-terminus. The human δ opioid receptor (h(δOR) has two polymorphic variants. A single-nucleotide polymorphism causes replacement of Phe with Cys at the amino acid position 27 in the receptor N-terminus. The allelic frequency of hδORCys27, the less common variant, is about 10% in Caucasians. In this study, the two hδOR variants were expressed in heterologous expression systems and their biosynthesis was characterized in detail using various cell biological and biochemical techniques. In particular, the role of receptor heteromerization and opioid receptor pharmacological chaperones in processing, maturation and trafficking of the variants was assessed. The hδOR variants showed significant differences in maturation and trafficking. The hδORCys27 had a significantly lower maturation efficiency compared with hδORPhe27. In addition, long-term receptor expression led to the accumulation of hδORCys27 in the endoplasmic reticulum (ER) and also impaired receptor targeting to ER-associated degradation. The hδOR variants also differed at the cell surface, as the hδORCys27 variant was internalized constitutively in a faster and more extensive manner than hδORPhe27. However, the variants had similar pharmacological properties and activated G proteins in an identical manner. This study also showed that hδORCys27 acted in a dominant negative manner and redirected some hδORPhe27 precursors to degradation. This resulted in impaired plasma membrane expression of hδORPhe27 in co-transfected cells. The hδOR variants were found to form heteromers early in the secretory pathway, which is the most likely reason for the dominant negative behavior of hδORCys27 on hδORPhe27. The mechanism of action of opioid receptor pharmacological chaperones, membrane-permeable opioid ligands, was investigated in detail using hδORCys27 and its mutant form hδORCys27-(Asp95Ala) as models. Opioid antagonists were found to be able to bind to and stabilize receptor precursors in the ER and enhance their dissociation from the ER molecular chaperone calnexin. This led to an increase in the number of receptors at the plasma membrane. In addition, hδORPhe27, like hδORCys27, was responsive to antagonist treatment whether the variants were expressed together or individually.
Tiivistelmä Opioidireseptorit kuuluvat G-proteiinikytkentäisiin reseptoreihin, ja niillä on tärkeä rooli kipuaistimuksen säätelyssä. Ne ovat solukalvoproteiineja, joiden aminohappoketju läpäisee kalvon seitsemän kertaa. Reseptorien aminoterminaalipää sijaitsee solun ulkopuolella ja karboksiterminaalipää solun sisällä. Ihmisen δ-opioidireseptori esiintyy kahtena polymorfisena muotona, Phe27:nä ja Cys27:nä, joissa aminohappo 27 on joko fenyylialaniini (Phe) tai kysteiini (Cys). Cys27 on harvinaisempi muoto, ja sen yleisyys on noin 10 % eurooppalaista alkuperää olevalla väestöllä. Tämän väitöskirjan tavoitteena oli tutkia δ-opioidireseptorin varianttimuotojen biosynteesiä reseptoriproteiinia tuottavissa heterologisissa solumalleissa (HEK293- ja SH-SY5Y-solut) solubiologisilla ja biokemiallisilla menetelmillä.. Väitöskirja osoittaa, että δ-opioidireseptorin varianttimuotojen välillä on eroa prosessoinnissa. Cys27-varianttia kuljetetaan endoplasmakalvostosta solun pinnalle vähemmän kuin Phe27-varianttia, ja pitkäaikainen reseptorituotanto johtaa vastasyntetisoituneiden reseptorien kerääntymiseen solun sisälle. Samalla reseptorien ohjaus proteasomihajotukseen heikkenee. Soluissa, jotka tuottavat molempia varianttimuotoja samanaikaisesti, Cys27-variantin havaittiin ohjaavan myös Phe27-varianttia proteasomihajotukseen vähentäen sen kuljetusta solun pinnalle. Tämä Cys27-variantin dominanttinegatiivinen ominaisuus johtuu todennäköisesti siitä, että variantit muodostavat dimeerisen rakenteen endoplasmakalvostossa. Havaittiin myös, että Cys27-varianttireseptorit ohjataan solun pinnalta lysosomihajotukseen tehokkaammin kuin vastaavat Phe27-varianttimuodot. Prosessointieroista huolimatta variantit eivät poikkea toisistaan farmakologisilta ominaisuuksiltaan, ja ne aktivoivat G proteiineja samalla tavalla. Väitöskirjassa tutkittiin myös farmakologisten kaperonien toimintamekanismeja käyttämällä mallina δ-opioidireseptorin Cys27-varianttia ja sen pistemutaatiota (Asp95Ala). Farmakologisten kaperonien eli reseptorispesifisten ligandien todettiin sitoutuvan reseptoreihin endoplasmakalvostossa ja stabiloivan niiden rakennetta, mikä vähentää reseptorin ja proteiinien laadunvalvontaan osallistuvan kaperonin, kalneksiinin, välistä vuorovaikutusta. Tämä johtaa reseptorien määrän kasvuun solun pinnalla.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
Externí odkaz: