Alcaligenes denitrificans subsp.denitrificans之N醯基-D- 胺基酸醯基水解 基因之分子選殖
| Autor: | ZHENG,ZI-HAO, 鄭子豪 |
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| Rok vydání: | 1991 |
| Druh dokumentu: | 學位論文 ; thesis |
| Popis: | 79 DA181 是本實驗室自土壤篩所得，為一能生產高活性之N-醯基-D胺基酸醯基水解 ， 簡稱D-胺基醯化 之菌株，經菌種鑑定結果知其為Alcaligenes denitrificans sub- sp.denitrificans。 由於DA181 本身所產生的D-胺基醯化 在生產D-胺基酸的製程中佔著舉足輕重的地位 ，因此我們想將此一基因選殖於大腸桿菌內表現。並且分析它的核 酸順序，期望能 對此基因做深入的研究。 本試驗將Alcaligenes denifticans DA181 之染色體DNA 抽出後，以限制 Mbo I 部 份切割，與Bam HI切割過之載體KS進行黏接。此等黏接混合物經轉形送入E.coli CSH 50內，共獲得一千多個轉形細胞，經D-amino acid oxidase法測試後，發現共有十三 株菌具有D-胺基醯化 的活性，但是能夠大量培養並且抽得到種組質體的只有一株， 將其命名為 459，其插入之DNA 片段約有20kb。 將 459的重組質體抽出，再進行次選殖，最後得到一轉形株28-6；具有L-胺基醯化 活性與微弱的D-胺基醯化 活性，其DNA 接入片段為 4.3kb。 因為D-胺基醯化 基因在CSH50 不穩定，會有嵌入染色體DNA 的情形。因此，將重組 質體p28-6 自CSH50 抽出轉形入XL1-BLUE。自XL1-BLUE中抽取大量重組質體 p28-6， 定出限制 圖譜，並且根據此限制 圖譜做出各種不同片段的次選殖，由這些次選殖 的菌株進行核 酸定序。最後得到p28-6 之4337個核 酸的順序。 利用電腦軟體PC／Gene，分析此4337個核 酸順序，可得到四個 ORF(open reading frame)。此四個ORF 與D-胺基醯化 的N 末端和胡湘玲所純化的L-胺基醯化 N 末端 做比對，並沒有相似性存在，和SWISS-PROT資料庫中的蛋白質胺基酸順序亦不存在相 似性。 為了獲得完整的D-胺基醯化 基因，以EMBL3 建立DA181 的基因庫，並利用D-胺基醯 化 的N 末端胺基酸順序合成探針，進行溶菌斑互交反應，惟至今尚未獲得肯定的結 果。 |
| Databáze: | Networked Digital Library of Theses & Dissertations |
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