Estudios sobre terapia fágica contra S. enterica en Gallus gallus

Autor: Bardina Fons, Carlota
Jazyk: španělština
Rok vydání: 2011
Předmět:
Zdroj: TDX (Tesis Doctorals en Xarxa).
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: Salmonella enterica es una enterobacteria zoonótica que reside en el intestino de los animales. Normalmente genera infecciones asintomáticas en animales de granja. Las serovariedades no tifoideas causan brotes asociados a alimentos siendo S. Enteritidis y S. Typhimurium las que presentan una mayor prevalencia a nivel mundial. La principal vía de transmisión de este patógeno a humanos se produce a través del consumo de alimentos contaminados de origen animal. Es por ello que, actualmente, se está promoviendo una actuación integrada en todos los niveles de la cadena alimentaria bajo el lema “de la granja a la mesa”. El principal reservorio de S. enterica son las especies aviares y en particular Gallus gallus. Por ello, la Unión Europea (UE) ha publicado una serie de regulaciones para intentar disminuir, sobretodo en Gallus gallus, la prevalencia de las principales serovariedades de Salmonella como S. Enteritidis y S. Typhimurium. No obstante, dado que con el uso de las medidas utilizadas hasta el momento no han permitido llegar al objetivo, se presenta una clara necesidad de disponer de nuevas herramientas para reducir la presencia de Salmonella en todo el sector de producción aviar. Por ello, el objetivo del presente trabajo ha sido aislar, seleccionar y caracterizar fagos de Salmonella, para estudiar su aplicación en Gallus gallus. Para abordar el objetivo propuesto, se aislaron bacteriófagos específicos de Salmonella, seleccionándose aquellos que presentaron mejores perfiles líticos, rango de huésped y cinética de infección sobre S. Typhimurium ATCC 14028 y S. Enteritidis LK5. Tras estosestudios, se escogieron a los fagos UAB_Phi20 y UAB_Phi87 como candidatos para terapia fágica y se procedió a su caracterización biológica y molecular. El estudio de estos parámetros indicó que el fago UAB_Phi20 pertenece a la familia Podoviridae y al grupo de fagos tipo P22, mientras el fago UAB_Phi87 es de la familia Myoviridae y del grupo de fagos tipo Felix O1. Ambos fagos presentaron una buena estabilidad a distintas temperaturas y pH, si bien su título disminuye significativamente a pH 2. El análisis de las secuencias de ambos fagos indicó que ninguno de ellos contiene genes de virulencia conocidos. Asimismo, se demostró in vitro que la acción combinada de ambos fagos, junto con el fago UAB_Phi78, provoca una mayor reducción de la concentración de Salmonella que la de los fagos individuales. La experimentación animal, realizada en un modelo murino y en Gallus gallus, demostró el corto tiempo de residencia de los fagos en el tracto intestinal de los animales y la necesidad de administrar repetidas dosis fágicas para conseguir un efecto significativo en la reducción de este patógeno. Así, se consiguió que el 50% de los ratones sobreviviera a la infección promovida por S. Typhimurium ATCC 14028 al administrar 1010 pfu/animal simultáneamente a la infección y a las 6, 24 y 30 horas después de la infección. Del mismo modo, en pollos infectados con S. Typhimurium y tratados con dos dosis diarias de 1010 pfu/animal el dia previo a la infección y los 4 días siguientes, junto con la readministración del cóctel en los días 6, 8, 10, 13 y 15 posinfección, produjo una reducción de Salmonella de más de 4 logaritmos durante los dos primeros días de la infección y de 1,5 logaritmos al final del experimento. Finalmente, dado que algunas de las problemáticas que se plantean ante el uso de bacteriófagos en terapia fágica son la selección de bacterias resistentes y la generación de una respuesta inmunitaria que bloquee la acción de los fagos, se estudió el impacto de dicho cóctel en la selección de bacterias resistentes en los animales tratados con fagos y se cuantificó su respuesta inmunitaria.
Salmonella enterica is a zoonotic enterobacteria mainly found in the gut of its hosts, which shows an asymptomatic course of infection in farm animals. Nontyphoidal Salmonella serovars cause gastroenteritis, being S. Enteritidis and S. Typhimurium the most prevalent serovars causing food outbreaks worldwide. The main route of transmission of this pathogen to humans occurs by the consumption of contaminated food from animals infected but not detected. For this reason and to assure the control of Salmonella along all the food chain, a global actuation known as “from the farm to the fork” has been stimulated. The main reservoirs of S. enterica are avian species, above all Gallus gallus. For this reason, the European Union (UE) makes efforts trying to decrease the main Salmonella. The main control strategy used until today is the vaccination. However, in some stages of the avian production is not applicable. Thus, it is necessary to dispose of other new measures to reduce Salmonella prevalence. In this context, the aim of this thesis was focused on the isolation, selection and characterization of new Salmonella bacteriophages to study their effectiveness as a control strategy in Gallus gallus. To address this aim, specific Salmonella bacteriophages were isolated, and Those bacteriophages which better lytic abilities and wider host ranges were selected. In this way, bacteriophages UAB_Phi20 and UAB_Phi87 were selected and further characterized. These studies revealed that the bacteriophage UAB_Phi20 is a virulent Salmonella phage from the Podoviridae family closely resembling to P22, while bacteriophage UAB_Phi87 is enclosed in the Myoviridae family closely related to the lytic bacteriophage Felix O1-like. Both phages, UAB_Phi20 and UAB_Phi87, are highly stable under different temperatures and pH. However, at extremely acidic pH values (pH 2) their viability is clearly compromised. The analysis of both genome sequences showed that none of them contain known virulence genes. Likewise, the in vitro infection kinetics of both phages, together with the new phage UAB_Phi78, as a cocktail in liquid cultures of Salmonella improved the reduction levels on the concentration of this pathogen. The efficacy of this new cocktail was assayed in a mice model and in Gallus gallus. In both cases, the results obtained showed that the time of residence of bacteriophages in the intestinal tract of animals was really short and that the administration of several doses to obtain significant effects on the reduction of this pathogen is necessary, improving its effect during the first days after bacterial infection. The approaches herein studied allowed a 50% reduction in mice death promoted by S. Typhimurium when 1010 pfu/ml was administered simultaneously to the infection and at 6, 34 and 30 hours after the bacterial infection. In the same way, in poultry infected with S. Typhimurium and daily treated with two doses of 1010 pfu/ml since the day before of the infection and during the successive 4 days, with single re-administrations of the phage cocktail on days 6, 8, 10, 13 and 15 after the bacterial infection, promoted a Salmonella reduction of over 4 logs during the first days and a reduction of 1.5 logs at the end of the experiment Finally and due the problematic set out on the selection of resistant bacterial and the activation of the immune system promoted by the use of bacteriophages, the impact of the phage cocktail on the selection of resistant bacteria in animals and their immune response was also evaluated.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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