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La capacidad de las leguminosas de establecer una asociación simbiotica con bacterias de suelo es de fundamental importancia para la incorporación de nitrógeno a los ecosistemas, particularmente en sistemas agronómicos. En el presente trabajo de tesis se estudió la dinámica de la asociación de transcriptos (mRNAs) y miRNAs a complejos traduccionales durante las etapas tempranas de la simbiosis. Para ello, inicialmente, se puso a punto de la técnica de purificación por afinidad de ribosomas y polisomas (TRAP) en Medicago truncatula. Se cuantificó la variación de los niveles de asociación a polisomas de quince mRNAs en respuesta a la inoculación con su simbionte Sinorhizobium meliloti. Se identificó un grupo de genes, cuyos mRNAs no varían significativamente a nivel de abundancia celular, pero que se regulan positivamente a nivel de su asociación a polisomas en respuesta al rizobio. Este grupo incluyó genes que codifican receptores de tipo quinasas requeridos para la infección bacteriana o la organogénesis del nódulo y factores de transcripción de la familia GRAS y NF-Y. Posteriormente, se evaluaron los niveles de asociación a polisomas de los mRNAs seleccionados en los tejidos específicos de la raíz involucrados en la formación de nódulos: epidermis, córtex y floema. Este análisis permitió identificar mRNAs que se asocian diferencialmente a polisomas en los distintos tipos celulares durante las etapas tempranas de la simbiosis. Por otro lado, se evaluó la presencia de pequeños RNAs (sRNAs) en los complejos traduccionales purificados mediante TRAP. Los sRNAs seleccionados, incluyendo miRNAs de 21 y 22 nts y tasiRNAs, se encontraron asociados a complejos traduccionales. En particular, los niveles de miR169 presentes en polisomas disminuyeron significativamente en respuesta a la inoculación. Esta dismunución se vió acompañada de un incremento en la asociación a polisomas de su gen blanco, NF-YA1, y de los niveles de la proteína en las raíces inoculadas. Estos resultados indican que tanto los mRNAs como los miRNAs estarían sometidos a un reclutamiento diferencial a polisomas y expone la importancia de la traducción selectiva durante la simbiosis. La extensión de la técnica TRAP a M. truncatula abre la posibilidad de profundizar este nivel de regulación tanto a nivel de raíz completa como de tipos celulares específicos en asociaciones simbióticas como la nodulación y la micorrización arbuscular. El presente trabajo de tesis contribuye a sustentar la relevancia de los niveles de regulación post-transcripcional en los cambios de la expresión génica que ocurren durante el establecimiento de una asociación simbiótica de importancia ecológica y agronómica. |
