Nichtlineare Mikroskopie und Bilddatenverarbeitung zur biochemischen Analyse synchronisierter Chlamydomonas-Zellen

Autor: Garz, Andreas
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2013
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Druh dokumentu: Text.Thesis.Doctoral
Popis: Unter geeigneten Wachstumsbedingungen weisen Algenkulturen oft eine größere Produktivität der Zellen auf, als sie bei höheren Pflanzen zu beobachten ist. Chlamydomonas reinhardtii-Zellen sind vergleichsweise klein. So beträgt das Zellvolumen während des vegetativen Zellzyklus etwa 50–3500 µm³. Im Vergleich zu höheren Pflanzen ist in einer Algensuspension die Konzentration der Biomasse allerdings gering. So enthält beispielsweise 1 ml einer üblichen Konzentration zwischen 10E6 und 10E7 Algenzellen. Quantifizierungen von Metaboliten oder Makromolekülen, die zur Modellierung von zellulären Prozessen genutzt werden, werden meist im Zellensemble vorgenommen. Tatsächlich unterliegt jedoch jede Algenzelle einer individuellen Entwicklung, die die Identifizierung charakteristischer allgemeingültiger Systemparameter erschwert. Ziel dieser Arbeit war es, biochemisch relevante Messgrößen in-vivo und in-vitro mit Hilfe optischer Verfahren zu identifizieren und zu quantifizieren. Im ersten Teil der Arbeit wurde ein Puls-Amplituden-Modulation(PAM)-Fluorimetriemessplatz zur Messung der durch äußere Einflüsse bedingten veränderlichen Chlorophyllfluoreszenz an einzelnen Zellen vorgestellt. Die Verwendung eines kommerziellen Mikroskops, die Implementierung empfindlicher Nachweiselektronik und einer geeignete Immobilisierungsmethode ermöglichten es, ein Signal-zu-Rauschverhältnis zu erreichen, mit dem Fluoreszenzsignale einzelner lebender Chlamydomonas-Zellen gemessen werden konnten. Insbesondere wurden das Zellvolumen und der als Maß für die Effizienz des Photosyntheseapparats bzw. die Zellfitness geltende Chlorophyllfluoreszenzparameter Fv/Fm ermittelt und ein hohes Maß an Heterogenität dieser zellulären Parameter in verschiedenen Entwicklungsstadien der synchronisierten Chlamydomonas-Zellen festgestellt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die bildgebende Laser-Scanning-Mikroskopie und anschließende Bilddatenanalyse zur quantitativen Erfassung der wachstumsabhängigen zellulären Parameter angewandt. Ein kommerzielles konfokales Mikroskop wurde um die Möglichkeit der nichtlinearen Mikroskopie erweitert. Diese hat den Vorteil einer lokalisierten Anregung, damit verbunden einer höheren Ortsauflösung und insgesamt geringeren Probenbelastung. Weiterhin besteht neben der Signalgewinnung durch Fluoreszenzanregung die Möglichkeit der Erzeugung der Zweiten Harmonischen (SHG) an biophotonischen Strukturen, wie der zellulären Stärke. Anhand der Verteilungsfunktionen war es möglich mit Hilfe von modelltheoretischen Ansätzen zelluläre Parameter zu ermitteln, die messtechnisch nicht unmittelbar zugänglich sind. Die morphologischen Informationen der Bilddaten ermöglichten die Bestimmung der Zellvolumina und die Volumina subzellularer Strukturen, wie Nuclei, extranucleäre DNA oder Stärkegranula. Weiterhin konnte die Anzahl subzellulärer Strukturen innerhalb einer Zelle bzw. eines Zellverbunds ermittelt werden. Die Analyse der in den Bilddaten enthaltenen Signalintensitäten war Grundlage einer relativen Konzentrationsbestimmung von zellulären Komponenten, wie DNA bzw. Stärke. Mit dem hier vorgestellten Verfahren der nichtlinearen Mikroskopie und nachfolgender Bilddatenanalyse konnte erstmalig die Verteilung des zellulären Stärkegehalts in einer Chlamydomonas-Population während des Wachstums bzw. nach induziertem Stärkeabbau verfolgt werden. Im weiteren Verlauf wurde diese Methode auch auf Gefrierschnitte höherer Pflanzen, wie Arabidopsis thaliana, angewendet. Im Ergebnis wurde gezeigt, dass viele zelluläre Parameter, wie das Volumen, der zelluläre DNA- und Stärkegehalt bzw. die Anzahl der Stärkegranula durch eine Lognormalverteilung, mit wachstumsabhängiger Parametrisierung, beschrieben werden. Zelluläre Parameter, wie Stoffkonzentration und zelluläres Volumen, zeigen keine signifikanten Korrelationen zueinander, woraus geschlussfolgert werden muss, dass es ein hohes Maß an Heterogenität der zellulären Parameter innerhalb der synchronisierten Chlamydomonas-Populationen gibt. Diese Aussage gilt sowohl für die als homogenste Form geltenden Synchronkulturen von Chlamydomonas reinhardtii als auch für die gemessenen zellulären Parameter im intakten Zellverbund höherer Pflanzen. Dieses Ergebnis ist insbesondere für modelltheoretische Betrachtungen von Relevanz, die sich auf empirische Daten bzw. zelluläre Parameter stützen welche im Zellensemble gemessen wurden und somit nicht notwendigerweise den zellulären Status einer einzelnen Zelle repräsentieren.
Under appropriate growth conditions cells of algae cultures often show a greater productivity than it is observed for cells in higher plants. The cells of Chlamydomonas reinhardtii are relatively small. The cell volume during the vegetative cell cycle ranges only between 50-3500 µm³. Compared to higher plants the concentration of biomass in an algal suspension is small. Thus, 1 ml of a suspension with a standard concentration contains between 10E6 and 10E7 algal cells. Quantification of metabolites or macromolecules, which are used for modeling of cellular processes, is usually carried out in the cell ensemble. However, every single algal cell undergoes an individual development, which makes the identification of characteristic universal system parameters far more complicated. The aim of this work was to identify and quantify relevant biochemical parameters, which were measured in vivo and in vitro using optical methods. In the first part, a Pulse Amplitude Modulation (PAM) measuring station was introduced to measure the variable chlorophyll fluorescence of individual cells. A commercial microscope was combined with sensitive detection electronics and the application of suitable immobilization methods. This allowed the achievement of a signal-to-noise ratio which made it possible to measure the fluorescence signals of individual living Chlamydomonas cells. In particular, cell volume and the chlorophyll fluorescence parameter Fv/Fm as a measure of the photosynthetic apparatus efficiency and cell fitness were determined. A high degree of cellular heterogeneity of these parameters in different development stages of synchronized Chlamydomonas cells was determined. In the second part, the imaging laser scanning microscopy and subsequent image analysis for quantitative detection of the growth-dependent cellular parameters were applied. A commercial confocal microscope was extended by the possibility of non-linear microscopy. Hereby, a more localized excitation of the samples was possible. Hence, a higher spatial resolution and lower overall sample stressing were achieved. Besides signal generation through fluorescence excitation, second harmonic generation (SHG) on biophotonic structures, such as cellular starch, was applied. Based on distribution functions cellular parameters were determined by using theoretical model approaches. This allowed the characterization of parameters that were not directly accessible by measurement. The morphological information of the image data enabled the determination of cell volume and volumes of sub-cellular structures such as nuclei, extra-nuclear DNA, and starch granules. Furthermore, the number of sub-cellular structures within a cell or a cell compound was determined. Analysis of signal intensities constituted the basis of relative quantification of cellular components such as DNA and starch. For the first time, the method of non-linear microscopy and subsequent image analysis enabled the characterization of the cellular starch distribution of a Chlamydomonas population during cell growth, and after induced starch degradation, respectively. Subsequently, this method was additionally applied to frozen sections of higher plants like Arabidopsis thaliana. As a result it was shown that many cellular parameters like volume, cellular DNA content, and number of starch granules are described by means of a log-normal distribution with growth-related parameterization. Cellular parameters, such as concentration and cellular volume, showed no significant correlations among each other. Therefore, it was concluded that there is a high degree of cellular parameter heterogeneity within synchronized Chlamydomonas populations. This applies not only to synchronized cultures of Chlamydomonas reinhardtii, which are currently considered as the most homogeneous form, but also to measured cellular parameters of intact cell assemblies in higher plants. The result is especially important for model-theoretic considerations, which are based on empirical data, and cellular parameters obtained from cell ensembles, respectively.
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