Contrôle des phages dans le lactosérum : étude de leur protection par les protéines sériques et identification d'un déterminant génétique responsable de leur résistance thermique

Autor: Geagea, Hany
Jazyk: francouzština
Rok vydání: 2018
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Druh dokumentu: Texte::Thèse::Thèse de doctorat
Popis: L’ajout de concentrés protéiques de lactosérum (CPLs) dans le fromage est limité à cause de la contamination par des phages lactiques résistants à la chaleur. En outre, les protéines de lactosérum peuvent protéger les phages contre la chaleur augmentant ainsi le risque de contamination. Le but de ce travail était d’expliquer cet effet protecteur et d’identifier un déterminant génétique responsable de la résistance thermique de phages lactiques. D’abord, l'inactivation thermique du phage résistant à la chaleur P1532 (groupe Sk1virus) a été étudiée dans des CPLs et dans trois de ses composantes majeures à 95 °C, en fonction du pH et de temps de chauffage. Les changements structuraux des protéines du lactosérum ont été suivis par spectroscopie FTIR. Les résultats d’inactivation thermique ont montré que les conditions acides des CPLs favorisent la destruction des phages laitiers par traitement thermique. Également, ils ont avéré que l’effet protecteur des protéines est dépendant du pH et du temps de chauffage, mais n'est pas dû à une protéine spécifique. Les spectres de FTIR ont montré que l’effet protecteur est relié à la structure et à l'agrégation des protéines. Ensuite, une étude plus approfondie a été menée sur cet effet protecteur, en utilisant la lactoferrine (LF) comme modèle des protéines sériques en raison de ses propriétés physico-chimiques uniques. Une évaluation détaillée de la structure tertiaire/secondaire de la LF a été effectuée en utilisant la spectroscopie FTIR ainsi que le dichroïsme circulaire. Après inactivation thermique de phage P1532, aucun effet protecteur de la LF n'a été détecté au pH neutre, alors qu’à pH 5, un effet protecteur marqué de la LF a été signalé. Les données des études spectroscopiques ont clairement montré que la LF est plus stable, au niveau de la structure tertiaire et secondaire, si elle est chauffée à pH 5 qu'à pH 7. En somme, il existe une corrélation directe entre la stabilité thermique des protéines sériques et la protection conférée au phage P1532 pendant le traitement thermique. Les résultats obtenus à cet égard offrent de nouveaux outils pour minimiser l’impact de l’effet protecteur sur les phages lactiques. Afin de mieux comprendre la résistance thermique intrinsèque des phages lactiques, un déterminant génétique a été identifié. Suite à l’exposition du phage virulent de L. lactis CB14 sensible à la chaleur (groupe Sk1virus) à des températures faibles et élevées, il a été possible d’isoler deux phages qui ont acquis une résistance thermique plus élevée. Le séquençage de leur génome a révélé une délétion de 120 pb dans le gène codant pour la TMP. Les séquences de protéines de TMP de phages mutants ont été comparées avec leurs homologues dans d'autres phages de L. lactis. L'analyse comparative a montré que la même délétion semble avoir eu lieu dans la TMP de phages thermorésistants P680 et P1532. Nous proposons que la TMP soit en partie responsable de la stabilité à la chaleur de phages lactiques. L'identification d’un déterminant génétique responsable de la résistance thermique des phages de groupe Sk1virus est une première étape pour comprendre l'émergence de ce groupe de phages thermostables, et peut conduire à des meilleures stratégies de contrôle.
The incorporation of whey protein concentrates (WPC) into cheese is a risky process due to the potential contamination with thermo-resistant phages of lactic acid bacteria (LAB). Furthermore, whey proteins can protect phages during heat treatment, thereby increasing the above risk. The objectives of this work were to understand this protective effect and to identify genetic determinant(s) responsible for the thermal resistance of lactococcal phages. First, the effect of pH and time of heating on the inactivation of lactococcal thermo-resistant phage P1532 (Sk1virus/936 group) was measured, at 95 ºC, in WPC and in three individual major whey components. The molecular structure changes of the tested proteins were also monitored by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. Phage inactivation results indicated that acidic conditions of WPC favor the destruction of dairy phages by heat treatment. Moreover, it revealed that the protective effect of whey proteins was pH and time dependent and was not restricted to one component. FTIR spectra suggest that the protection is related to protein molecular structures and to the level of protein aggregates. Then, to further investigate this protection, we used lactoferrin (LF) as a whey protein model as a result of its unique physicochemical properties. We combined FTIR and circular dichroism (CD) spectroscopies to monitor the structural conformational changes of LF. Phage inactivation results revealed a strong protective effect of LF on P1532 phage at pH 5 but none at pH 7. Spectroscopic analysis showed that LF was unfolded after heating at pH 7, while it preserved its tertiary and secondary structures when heated at pH 5. In sum, there is a direct correlation between the thermal stability of whey proteins and their ability to protect P1532 phage from heat treatment. The results obtained in this respect offer new tools to minimize the impact of the protective effect on lactococcal phages. In order understand the thermal resistance of LAB phages, we aimed to identify genetic determinant(s) responsible for the thermal resistance of lactococcal phages. After challenging CB14 heat-sensitive phage (Sk1virus/936 group) to low and high temperatures, two phages with increased thermal resistance were selected. Sequencing of their genome revealed a 120 bp deletion in the gene coding for the tape measure protein (TMP). The TMP protein sequences of mutant phages were compared with their homologues in other wild-type L. lactis phages with a wide diversity in heat stability. Comparative analysis of TMP proteins of other lactococcal phages identified the same deletions in the extremely heat-stable phages P680 and P1532. We propose that the TMP is, in part, responsible for the heat stability of the highly predominant lactococcal phages of the Sk1virus group. Identifying this genetic determinant for Sk1virus heat stability is a first step to understand the emergence of this group of thermostable phages, and may lead to improved control strategies in the cheese industry
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