Estudo de microRNAs relacionados a ritmos circadianos: identificação e validação de candidatos, perfil transcriptômico e impacto na normalização de ensaios de expressão gênica

Autor: Figueredo, Diego de Siqueira
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2018
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFALUniversidade Federal de AlagoasUFAL.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: FAPEAL - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas
Estima-se que 50% dos genes codificadores de proteínas possuem oscilação rítmica em diferentes tecidos de mamíferos. Curiosamente, metade das proteínas desses genes possuem seus RNAm correspondentes com expressão constitutiva (arrítmica), ressaltando a relevância de eventos pós-transcricionais para a oscilação de proteínas. Os “High throughput Assays” (HTA) circadianos são extremamente importantes, pois fornecem informações acerca da expressão de milhares de transcritos e de proteínas, uma rica coleção cronobiológica que pode ajudar na resolução de diferentes problemas científicos, não apenas os abordados nas pesquisas originais. Embora altamente reprodutivos e informativos, ensaios de biologia molecular circadiana apresentam algumas divergências em seus resultados, ressaltando a necessidade do aprimoramento de métodos de normalização e análise dos diferentes ensaios de expressão. Até o momento, não se conhecem os impactos da normalização do RNA em ensaios de expressão de pequenos RNAs, como miRNAs. Este estudo objetivou: (1) analisar a co-expressão de miRNAs e RNAm e proteínas de genes alvos; (2) identificar e validar miRNAs candidatos ao sistema molecular circadiano; (3) analisar o impacto da normalização do RNA total em estudos circadianos de miRNAs. Através da sistematização de diferentes dados circadianos de HTA (RNA-seq, small RNA-seq, Chip-seq e proteoma), de bioinformática e de interações miRNA:RNAm validadas, identificamos uma lista de 152 microRNAs (miRNAs) candidatos ao controle pós-transcricional dos ritmos moleculares. Desses, os dois mais relevantes, miR29b-3p e miR-23b-3p, foram experimentalmente validados como importantes para a manutenção do período dos ritmos das células U2OS PER2:LUC. Análises de HTA também permitiram a identificação de diferenças nas fases de expressão de miRNAs 3p e 5p, com genes alvos divergentes. Interessantemente, a identificação de padrões de expressão de RNAm e proteínas de genes alvos de miRNAs, permite sugerir um mecanismo de ajuste das amplitudes dos ritmos das proteínas dependente da fase do RNAm. Por fim, através do controle de etapas experimentais, demonstramos oscilação circadiana na concentração do RNA total de diferentes regiões de cérebros de camundongos. A normalização desse ritmo, durante a síntese de cDNA, afeta o perfil de expressão de transcritos, incluindo os dos genes relógio Per1-2 e Bmal1. Ademais, através de análises com RNA exógeno, ou spike-ins, demonstramos que o ajuste da concentração do RNA compromete a análise de miRNAs, possivelmente por interferências nos rendimentos de extração e nas reações de síntese de cDNA. Este estudo apresenta dois novos miRNAs importantes para a manutenção da ritmicidade circadiana e uma nova estratégia de análise de qPCR para estudos cronobiológicos de miRNAs.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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