Estudos experimentais sobre os mecanismos patogênicos na cistinose : efeitos da cistina sobre alguns parâmetros bioquímicos em rins de ratos jovens

Autor: Rech, Virgínia Cielo
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2007
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGSUniversidade Federal do Rio Grande do SulUFRGS.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: A cistinose é uma doença genética letal causada pelo transporte deficiente de cistina para fora dos lisossomos, levando ao acúmulo intralisossomal de cistina na maioria dos tecidos, principalmente no rim. O tratamento precoce com cisteamina, um aminotiol capaz de remover a cistina acumulada nos lisossomos, retarda a evolução da doença. Embora o dano tecidual dependa do acúmulo do dissulfeto cistina, os mecanismos responsáveis por este dano ainda não estão esclarecidos. A sobrecarga de lisossomos com dimetil cistina éster tem sido usada para estudar a patogênese da cistinose. Túbulos renais proximais isolados de ratos e de coelhos, sobrecarregados com dimetil cistina éster desenvolveram deficiência na reabsorção tubular semelhante à observada na síndrome de Fanconi, a principal manifestação clínico-laboratorial da cistinose. Estudos realizados com fibroblastos de pacientes cistinóticos e com células tubulares renais sobrecarregadas com dimetil cistinal éster sugerem que a apoptose está aumentada nesta doença. O acúmulo de cistina também induz queda nos níveis intracelulares de glutationa e de ATP, mesmo com a capacidade mitocondrial geradora de ATP intacta. Considerando que a creatinaquinase é uma enzima tiólica crítica para a homeostasia energética renal e que pode ser alterada por dissulfetos, nós investigamos os efeitos in vivo e in vitro da cistina sobre a atividade desta quinase em rim de ratos Wistar jovens. Os resultados mostraram que a cistina inibiu a atividade da creatinaquinase in vivo e in vitro. A inibição foi do tipo não competitivo e dependente da concentração do inibidor e do tempo de pré-incubação, sendo prevenida e revertida por cisteamina e por glutationa, sugerindo a oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento da enzima. Com o objetivo de investigar se a inibição causada pela cistina era específica para a creatinaquinase renal ou poderia ocorrer também com outras enzimas tiólicas de outros tecidos, nós estudamos os efeitos da sobrecarga de dimetil cistina éster sobre as enzimas tiólicas creatinaquinase e piruvatoquinase, bem com sobre a enzima não tiólica lactato desidrogenase, em rim e córtex cerebral de ratos Wistar jovens. Os animais foram injetados subcutaneamente com dimetil cistina éster na dose de 1,6 μmol/g de peso corporal e/ou cisteamina na dose de 0,46 μmol/g de peso corporal do décimo sexto ao vigésimo dia de vida, tendo sido mortos por decapitação sem anestesia 12 horas após a última injeção. A administração de cistina dimetiléster diminuiu a relação tiol/dissulfeto sem alterar a atividade da lactato desidrogenase, mas inibiu a atividade das duas quinases, tanto no rim, quanto no córtex cerebral. A administração de cisteamina normalizou a relação tiol/dissulfeto e a atividade das duas quinases em ambos tecidos, reforçando a hipótese de que a cistina causa a inibição de enzimas tiólicas, provavelmente por meio da oxidação de grupos tiólicos essenciais para o funcionamento destas enzimas. Considerando que a cistina é um potencial oxidante e o estresse oxidativo pode alterar a função das proteínas tiólicas e induzir apoptose, nós investigamos os efeitos da sobrecarga de cistina dimetiléster sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em rim de ratos Wistar jovens. A cistina dimetiléster induziu lipoperoxidação, carbonilação de proteínas, e estimulação da atividade da superóxido dismutase, glutationa peroxidase e catalase, provavelmente por meio da formação de ânions superoxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas. A administração de cisteamina preveniu, ao menos em parte, estes efeitos, sugerindo que este aminotiol aja como um “scavenger” de radicais livres. Considerando todos os resultados em conjunto, podemos presumir que a cistina induz estresse oxidativo, inibindo enzimas tiólicas com consequentes alterações metabólicas, tais como diminuição da homeostasia metabólica e redução dos níveis dos antioxidantes piruvato, creatina epossivelmente glutationa. Se estes efeitos também ocorrerem nos pacientes cistinóticos, eles poderiam contribuir para o dano celular que ocorre nesta doença.
Cystinosis is a lethal genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency od cystine, leading to intra-lysosomal cystine accumulation in most tissues, specially in kidney. Early treatment with cysteamine, a cystine-depleting aminothiol, extends life of affected patients. Although tissue damage might depend on accumulation of the disulfide cystine, the mechanisms of tissue damage are not fully understood. Lysosomal loading with cystine dimethyl ester has been used for studying the pathogenesis of cystinosis. Isolated proximal renal tubules from rats and rabbits loaded with CDME developed defective proximal tubular reabsorption, similar to that of Fanconi syndrome in cystinosis Studies performed in fibroblasts of cystinotic patients and in kidney cells loaded with cystine dimethyl ester suggest that apoptosis is enhanced in this disease. Cystine accumulation also induces decrease of glutathione and of intracellular ATP content with intact energy generating capacity of mitochondria. Considering that creatine kinase, a thiol-containing enzyme, is critical for renal energy homeostasis and may be altered by disulfides, we investigated the in vivo and in vitro effects of cystine on this kinase in the kidney of young Wistar rats. Results showed that cystine inhibited in vivo and in vitro the enzyme activity and that this inhibition was of the non competitive type, time and concentration dependent, prevented and reversed by cysteamine and glutathione, suggesting that creatine kinase inhibition was caused by oxidation of essential sulfhydryl groups necessary for the enzyme function. Next, to investigate whether this inhibition was specific for renal creatine kinase, or might occur for other thiol-containing enzymes in other tissues, we studied the effects of cystine dimethylester load on the thiol-containing enzymes creatine kinase and pyruvate kinase, in the kidney and brain of young Wistar rats. We also studied these effects on lactate dehydrogenase, a non-containing thiol enzymae. The animals were injected twice a day with 1.6 μmol/g body weight cystine dimethylester and/or 0.46 μmol/g body weight cysteamine from the 16th to the 20th postpartum day and killed after 12 hours. Cystine dimethylester administration decreased thiol/disulfide ratio and inhibited the two enzyme activities in tissues, but not lactate dehydrogenase activity, a non-containing thiol enzyme. Co-administration of cysteamine normalized thiol/disulfide ratio and the two enzyme activities, reinforcing the hypothesis that cystine inhibits thiol containing enzymes possibly through oxidation of essential thiol groups of the enzymes. Considering that cystine is a potential oxidant and oxidative stress is known to alter the function of thiol containing proteins and induce apoptosis, we investigated the effects of cystine dimethyl ester loading on several parameters of oxidative stress in the kidney of young rats. Cystine dimethyl ester induced lipoperoxidation, protein carbonylation, and stimulated superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities, probably through the formation of superoxide anions, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals. Coadministration of cysteamine prevented, at least in part, those effects, possibly acting as a scavenger of free radicals. Taken together all the results, it can be presumed that cystine induces oxidative stress inhibiting thiol-containing enzymes with consequent metabolic alterations such as diminution of energy homeostasis and reduction levels of the antioxidants pyruvate, creatine, and possibly glutathione. If these effects also occur in cystinotic patients, they could contribute to tissue damage that occurs in this disease.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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