Investigação do Silenciamento Gênico Produzido por Pequenos RNAs de Interfência no Ciclo Replicativo do Vírus da Hepatite A

Autor: Lopes, Juliana Freitas
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2009
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da FIOCRUZFundação Oswaldo CruzFIOCRUZ.
Druh dokumentu: masterThesis
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Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil
O vírus da hepatite A (HAV) possui genoma RNA de fita simples de 7,5 Kb e polaridade positiva. Este vírus pertence à família Picornaviridae, gênero Hepatovirus, com propriedades biológicas únicas, em particular, o crescimento lento em cultura celular com ausência de efeito citopático. O HAV causa uma infecção autolimitada normalmente com pouco ou nenhum sintoma em pacientes jovens (abaixo de 5 anos). Já em pacientes adultos, sintomas graves podem aparecer com 1% dos casos podendo evoluir para uma hepatite fulminante. A inibição da replicação viral pode retardar a infecção pelo vírus prevenindo uma hepatite fulminante. Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) que agem com base na degradação seqüência-específica do genoma, pode constituir uma nova estratégia para a inibição específica de vários tipos de vírus. A interferência por siRNA é um processo onde fitas duplas de RNA (dsRNA) são capazes de silenciar as funções específicas de um gene alvo. A via de siRNA pode ser induzida em células por transfecção de oligômeros sintéticos de 21-23 nucleotídeos. O objetivo deste estudo foi avaliar o silenciamento produzido por três seqüências específicas de siRNAs, uma para região 2C (helicase), e duas para 3D (protease) do genoma do HAV. Vinte e quatro horas antes da transfecção, células FRHK-4 foram cultivadas em placas de 24 poços, com meio 199 e densidade de 10 5 células por poço. Em seguida, as células foram transfectadas por 4 horas com cada siRNA e suas combinações. Após isto, as células foram infectadas com o HAV (10 5 cópias/ml) e cultivadas por cinco dias consecutivos à 37°C. Seqüências não-específicas foram utilizadas como controle negativo. O RNA total foi extraído e a análise foi realizada por RT-PCR, sendo o silenciamento confirmado por imunofluorescência. Todas as seqüências mostraram-se com capacidade inibitória. A melhor taxa de silenciamento ocorreu no segundo dia com as três sequências em conjunto, atingindo 85% de inibição da replicação viral. Tal resultado foi confirmado pela diminuição da intensidade da fluorescência para o HAV. As combinações foram mais eficazes do que cada sequência utilizada isoladamente. Os siRNAs foram eficazes na diminuição da expressão da helicase e protease do HAV
Hepatitis A virus (HAV) has a single-stranded RNA genome of 7.5 kb with positive polarity.This virus belongs the Picornaviridae family, genus Hepatovirus with unique biological properties, in particular, slow growth in cell culture without cytopathic effect. HAV causes a self-limiting liver infection with usually mild or no symptoms in young patients. Whereas adult patients might suffer from severe symptoms and 1% of cases can evolue to fulminant hepatitis. Inhibition of viral replication can improve viral infection and thus prevent fulminant failure. Small interference RNA (siRNA) based on specific sequence may present a novel and specific approach strategy for inhibit of various types of virus. RNA interference is a process by double-stranded (dsRNA) is able to silence specific gene functions. The siRNA pathway can be induced in mammalian cells by transfection of short synthetic sequence-specific oligomers with 21-23 nucleotides. The aim of this study was to evaluate the silencing produced by three specific sequences of siRNAs, one for region 2C (helicase), and two for 3D (protease) of the HAV. Twenty-four hours before transfection, FRHK-4 cells were cultivated in 24-well plate in 199 medium with density of 10 5 cells per well. After that, cells were transfected for 4 hours with each siRNA and its combinations following by infection with HAV (10 5 cópies/ml) and grown for five consecutive days. Non-specific sequences were used as negative control. The total RNA was extracted (with commercial kit) and analysis was performed by RT-PCR and silencing was confirmed by immunofluorescence. All sequences showed inhibitory capacity. The best silencing occurred in the second day using the three sequences together reaching 85% of inhibition viral replication. This result was confirmed with the decrease in fluorescence intensity for HAV. The combination of the sequences was more effective than the sequences used alone. The siRNAs could knockdown the expression of helicase and protease of HAV
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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