Otimização de PCR tradicional e em tempo real para detecção de Campylobacter spp. e Salmonella spp. em alimentos

Autor: Juliane Alves
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2014
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UELUniversidade Estadual de LondrinaUEL.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: Salmonella spp. e Campylobacter spp. são as causas mais frequentes de doenças bacterianas transmitidas por alimentos no mundo. O monitoramento dessas bactérias em alimentos é essencial para o controle da doença humana. Os métodos convencionais de isolamento de Campylobacter e Salmonella em alimentos podem requerer de quatro a dez dias para a conclusão dos resultados. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é empregada na área de alimentos devido a sua rapidez e especificidade na detecção de patógenos. Embora vários kits comerciais estejam disponíveis, o seu alto custo dificulta o uso nos laboratórios de diagnóstico e controle de qualidade, principalmente em países em desenvolvimento como o Brasil. A otimização de ensaios moleculares específicos e, principalmente, a detecção simultânea dessas duas bactérias patogênicas vem de encontro à necessidade desses laboratórios. O objetivo deste trabalho foi otimizar ensaios de PCR e extração de DNA para a detecção de Salmonella spp. e Campylobacter spp. em diferentes matrizes alimentares. Nas reações otimizadas utilizou-se o par de iniciadores Styinva-JHO, específico para Salmonella spp., que gerou um amplicom de 119 pares de bases. O par de iniciadores específico para Campylobacter spp. foi OT1559 e 18-1 gerando um amplicom de 287 pares de bases. A especificidade dos ensaios PCR otimizados foi de 100% e a sensibilidade foi de 1 UFC de Campylobacter ou Salmonella por mililitro da enxaguadura das diferentes amostras de alimentos testadas, após etapa de enriquecimento. A prevalência de Campylobacter spp., nas análises feitas em amostras de cortes de frango, foi de 60,9% (64/105). C. jejuni foi identificada em 28,1% (18/64) das amostras positivas para Campylobacter spp. e C. coli foi identificada na mesma proporção 28,1% (18/64). C. jejuni e C. coli foram identificadas simultaneamente em 12,5% (8/64) das amostras. Os ensaios PCR e as técnicas de extração de DNA otimizadas neste trabalho são uma alternativa rápida, barata e eficiente para detecção de Samonella spp. e Campylobacter spp. em alimentos, após o enriquecimento. A redução do tempo de análise e a eficiência na detecção destes patógenos são de grande importância para laboratórios de análises de alimentos na identificação do alimento contaminado e origem do surto.
Salmonella spp. and Campylobacter spp. are the most frequent causes of food-borne diseases worldwide. The control of these bacteria in food is essential for the control of human disease. Conventional detection methods of Campylobacter and Salmonella in food demand four to ten days. Polymerase chain reaction (PCR) have been developed for detection, identification and quantification of those bacteria in foods due to their rapidity and specificity. Although there are several commercial kits available, their high cost makes routine use in quality control and diagnostic laboratories difficult, especially in developing countries such as Brazil. The development of a specific molecular assay and especially the simultaneous detection of both pathogenic bacteria would be essential for these laboratories. The aim of this study was to develop PCR assays and DNA extraction procedure for detection of Salmonella spp. and Campylobacter spp. in different food matrices. The PCR was developed using the primers Styinva-JHO specific for Salmonella spp. that amplified a 119 bp fragment. The primers specific for Campylobacter spp was OT1559 and 18-1 which amplified DNA fragments of 287 bp. The assay specificity was 100%. After the enrichment step, the PCR detected 1 CFU of Campylobacter spp. or Salmonella spp. per milliliter of rinse of samples from different foodstuffs. The prevalence of Campylobacter spp., in chicken cuts samples was 60.9% (64/105). C. jejuni was identified in 28.1% (18/64) of the positive samples for Campylobacter spp. and C. coli was identified in the same proportion 28.1% (18/64). C. jejuni and C. coli were identified simultaneously in 12.5% (8/64) of samples. The developed PCR assays and DNA extraction procedure are rapid, inexpensive and eficient alternative for Samonella spp. and Campylobacter spp. detection in foods after enrichment. The reduction in analysis time and the efficiency in detection of these pathogens have a great importance for food analysis laboratories identification of contaminated food and source of the outbreak.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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