Clonagem e expressão do gene paa e resposta imune humoral de matrizes suínas vacinadas com proteínas recombinantes (F4, F5, F6, F18, F41 e Paa) de Escherichia coli patogênicas

Autor: Daniele Araujo Pereira
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2014
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UELUniversidade Estadual de LondrinaUEL.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: Escherichia coli (E. coli) enterotoxigênica (ETEC) é considerada importante causa de diarreia em suínos neonatos e desmamados. A adesão da bactéria à célula do hospedeiro é considerada um fenômeno específico entre as adesinas fimbriais e não fimbriais com seus respectivos receptores nos enterócitos. Os distúrbios entéricos estão relacionados com as fímbrias F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41 e F18. Além da ETEC, outra categoria de E. coli pode causar diarreia nos suínos, denominada de PEPEC (porcine pathogenic E. coli), a qual produz a adesina Paa (Porcine attaching adherence) capaz de provocar uma lesão típica denominada A/E (attaching and effacing). A imunização das matrizes com adesinas é importante para estimular a produção de anticorpos e a consequente transferência através do colostro aos leitões. O objetivo deste trabalho foi produzir uma vacina inovadora e completa para E. coli e comparar a resposta imune das matrizes imunizadas com as proteínas recombinantes (ETEC e EPEC) com uma vacina comercial de ETEC. O trabalho foi realizado em uma granja comercial, onde foram utilizadas nove matrizes suínas prenhes divididas em três grupos. O grupo um (G1) foi vacinado com as proteínas recombinantes (n=3), o grupo dois (G2) foi vacinado com vacina comercial (n=3) e o grupo três (G3) foi inoculado com salina tamponada estéril (PBS) (n=3). As proteínas recombinantes foram obtidas após a indução das amostras de E. coli BL21 (DE3) com adição de lactose. O grau de pureza foi analisado em gel SDS-PAGE corado com Comassie. A dose da vacina de proteínas recombinantes continha 100µg de cada antígeno recombinante e adjuvante Hidróxido de Alumínio 2mg/ml com conservante Timerosal a 0,02%. As matrizes prenhes foram imunizadas quatro e duas semanas antes do parto. Amostras de sangue das matrizes foram coletadas para avaliação dos níveis de anticorpos através do teste de ELISA indireto, no dia da primeira dose (dia 0), na segunda imunização (dia 14) e no dia do parto (dia 28). Quatro leitões de cada matriz foram selecionados para analisar o soro. A vacina comercial continha quatro fímbrias (K88, K99, F41, 987) e a vacina de proteína recombinante cinco fímbrias (rF18, rK88, rK99, rF41, r987) e rPaa. Os resultados foram submetidos ao Teste de Kruskal-Wallis para verificar diferença entre os grupos analisados que se identificado foi aplicado o Teste de Dunn a 6% de significância. Os animais inoculados com a vacina recombinante apresentaram reatividade maior que os animais inoculados com a vacina comercial e animais do grupo controle (PBS). A vacina de proteína recombinante obteve uma resposta vacinal significativa nas matrizes com as fímbrias (K99, F18, K88 e 987) e nos leitões com as fímbrias (K99, F18, 987, F41, K88). A vacina de proteína recombinante estimulou a resposta imune humoral específica nas matrizes, mas não foi possível afirmar se houve proteção dos leitões. Os resultados mostram a importância da vacinação das matrizes para aumentar os níveis de anticorpos anti-fimbrias e assim prevenir a diarreia.
Escherichia coli (E. coli) enterotoxigenic (ETEC) is an important cause of diarrhea in newborn and weaned pigs. The adhesion of bacteria to the host cell is considered a specific phenomenon among fimbrial adhesins and no fimbrial with their respective receptors on enterocytes. Enteric disorders are related with the fimbriae F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F41 and F18. In addition to the E. coli ETEC another category can cause diarrhea in pigs, called PEPEC (porcine pathogenic E. coli), which produces the adhesin Paa (Porcine attaching adherence) can cause a typical lesion termed A/E (attaching and effacing). Immunization of sows with adhesins is important to stimulate the production of antibodies and the subsequent transfer through colostrum in piglets. The aim of this study was produce an innovative and complete vaccine for E. coli and compare the immune response in sows immunized with recombinant proteins (ETEC and EPEC) with a commercial vaccine (ETEC). The study was conducted on a commercial farm, where nine pregnant sows divided into three groups were used. Group one (G1) were vaccinated with the recombinant protein (n = 3), the group two (G2) was vaccinated with the commercial vaccine (n = 3), Group three (G3) was inoculated with sterile phosphate buffered saline (PBS) (n = 3). The recombinant proteins were obtained after induction of the E. coli strains BL21 (DE3) containing added lactose. The purity was analyzed in SDS-PAGE gel stained with Coomassie. The dose of the vaccine of recombinant proteins contained 100?g of each recombinant antigen and adjuvant Aluminium Hydroxide 2mg/ml with 0.02% Thimerosal preservative. The pregnant sows were immunized four and two weeks before delivery. Blood samples from the mothers were collected for assessment of antibody levels by indirect ELISA, in the the first dose (day 0), the second immunization (day 14) and at parturition (day 28). Four piglets from each sow were selected to analyze the serum. The commercial vaccine contained four fimbriae (K88, K99, F41, 987) and recombinant protein with vaccine five fimbriae (rF18, rK88, rK99, rF41, r987) and rPaa. The results were submitted to the Kruskal - Wallis test to verify differences between groups analyzed that identified test was applied Dunn to 6 % significance level. The animals inoculated with the recombinant vaccine showed higher reactivity than animals inoculated with commercial vaccine and the control group (PBS). The vaccine of recombinant protein vaccine achieved a significant response in sows with fimbriae (K99, F18, K88, 987) and in piglets with fimbriae (K99, F41, 987, F18, K88). The recombinant protein vaccine stimulated specific humoral immune response in sows, but we are unable to say whether there was protection of piglets. The results show the importance of vaccinating in sows to increase the levels of anti-fimbriae antibodies and prevent diarrhea.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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