Proteases de Beauveria bassiana : indução e polimorfismo genético

Autor: Danielle Cardoso Gimenes
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2013
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UELUniversidade Estadual de LondrinaUEL.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: Beauveria bassiana é um fungo entomopatogênico muito estudado e aplicado no controle de insetos-praga. O mecanismo de infecção envolve a produção de enzimas extracelulares que degradam a cutícula do inseto. As proteínas são os principais constituintes da procutícula dos insetos, devido a isso, as proteases desempenham um importante papel na penetração cuticular. Proteases podem ser induzidas em cultivos submersos na presença de indutores de natureza proteica e poucos estudos foram realizados sobre análise de polimorfismos de genes envolvidos com proteases e outros fatores de virulência do fungo B. bassiana. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi induzir a produção de proteases extracelulares e avaliar a ocorrência de polimorfismos nos genes codificadores de proteases de B. bassiana. A cepa CG432 de B. bassiana foi cultivada em meio mínimo de Vogel suplementado com os indutores: cutícula de cigarras, larvas de Aedes aegypti, caseína, quitina, gelatina, ureia e os aminoácidos metionina, prolina, alanina e glicina e inoculado à 106 esporos mL-1, mantidos a 28°C, 200 rpm durante 5 dias. Extratos enzimáticos obtidos pela centrifugação foram analisados quanto ao teor de proteínas, produção de biomassa e atividade de proteases. Dos substratos analisados nos meios de cultura, a cutícula de cigarras, as larvas de Aedes aegypti e a caseína apresentaram maior atividade de proteases e, entre os aminoácidos, a metionina foi que apresentou melhor resultado. Entre esses indutores a cutícula e as larvas foram os que induziram maior atividade específica da enzima e a caseína contribuiu para o maior crescimento da biomassa fúngica. Posteriormente três indutores foram escolhidos: larvas de Aedes aegypti, caseína e metionina e a influência destes, na produção de proteases, foi avaliada utilizando um delineamento de misturas composto por 7 ensaios com 2 repetições no ponto central. O micro-organismo foi cultivado em meio de Vogel suplementado com os indutores e inoculado à 106 esporos mL-1, mantido a 28ºC, 150 rpm por 5 dias. Extratos enzimáticos obtidos foram analisados quanto à atividade de proteases e sua atividade específica, ao teor de proteínas, produção de biomassa e especificidade da enzima. Entre os indutores analisados, as larvas de A. aegypti induziram uma maior atividade de proteases, como também a atividade específica desta enzima, a caseína influenciou no aumento da produção de biomassa fúngica e a adição dos três indutores aumentou o teor de proteínas. Em todos os ensaios contendo larvas de Aedes aegypti houve a produção de proteases tipo-subtilisina (Pr1). Para a análise do polimorfismo nos genes codificadores de proteases, foram utilizadas 16 cepas de B. bassiana isoladas de diferentes insetos e origens geográficas, foi realizada a extração do DNA, amplificação e sequenciamento. A amplificação dos genes que codificam proteases resultou em um produto de aproximadamente 400 pb para todas as cepas testadas, os fragmentos amplificados foram sequenciados e as sequências utilizadas para a montagem de um dendrograma, onde foi analisado o polimorfismo genético entre as cepas. A análise indicou a formação de dois agrupamentos diferentes, sendo que essa variabilidade genética não foi correlacionada com a atividade de protease, inseto hospedeiro e origem geográfica.
Beauveria bassiana is an entomopathogenic fungus extensively studied and applied in the control of insect pests. The mechanism of infection involves the production of extracellular enzymes that degrade the insect cuticle. The proteins are the major constituents of the procuticle insects, because of this, proteases play an important role in cuticular penetration. Proteases can be induced in cultured submerged in the presence of induced protein nature and few studies have been conducted on the analysis of polymorphisms of genes involved with proteases and other virulence factors of the fungus B. bassiana. Therefore, the objective of this study was to induce the production of extracellular proteases and evaluate the occurrence of polymorphisms in genes encoding proteases of B. bassiana. The CG432 strain of B. bassiana was grown on Vogel's minimal medium supplemented with the inducer: cuticle cicadas, Aedes aegypti larvae, casein, chitin, gelatin, urea, and amino acids methionine, proline, alanine and glycine and inoculated with 106 spores ml-1, maintained at 28 ° C, 200 rpm for 5 days. Enzyme extract obtained by centrifugation were analyzed for protein content, biomass and protease activity. Of the substrates examined in the culture media, the cuticle of cicadas, the larvae of Aedes aegypti and casein had higher protease activity and, between amino acids, methionine was presented the best result. Among these inductors cuticle and larvae that were induced higher specific activity of the enzyme and casein contributed to the higher growth of fungal biomass. Subsequently three inductors were chosen: larvae of Aedes aegypti, casein and methionine and their influence on the production of proteases was assessed using a mixture design consists of 7 trials with two repetitions at the center point. The organism was grown in Vogel's medium supplemented with inducers and inoculated at 106 spores mL-1, maintained at 28ºC, 150 rpm for 5 days. Enzymatic extracts obtained were analyzed for protease activity and its specific activity, protein content, biomass and enzyme specificity. Among the inductors analyzed larvae of A. aegypti induced a higher activity of proteases, but also the specific activity of this enzyme, casein influence the increased production of fungal biomass and addition of the three inductors increased protein content. In all assays containing Aedes aegypti larvae was the production of subtilisin-like proteases (Pr1). For the analysis of the polymorphism in genes encoding proteases were used 16 strains of B. bassiana isolates from different geographical origins and insects, we performed DNA extraction, amplification and sequencing. The amplification of the genes encoding proteases resulted in a product of approximately 400 bp for all strains tested, the amplified fragments were sequenced and the sequences used for the assembly of a dendrogram, which was analyzed genetic polymorphism between strains. The analysis indicated the formation of two different groups, and this genetic variability was not correlated with the activity of protease, insect host and geographical origin.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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