Produção e imobilização da lipase de Botryosphaeria ribis EC-01 e aplicações

Autor: Milena Martins Andrade
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2013
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UELUniversidade Estadual de LondrinaUEL.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: Subprodutos do processamento de óleos vegetais como as tortas vegetais constituem substratos baratos para a fermentação microbiana de produção de lipases, que podem ser aplicadas na catálise de reações de transesterificação para a síntese de biodiesel. O objetivo deste trabalho foi produzir um catalisador estável e de baixo custo para aplicação na produção de biodiesel. Planejamentos estatísticos utilizando-se a Metodologia de Superfície de Resposta foram realizados com o intuito de avaliar a produção de lipase pelo fungo Botryosphaeria ribis EC-01 em condição de fermentação submersa. Após seleção das variáveis que mais influenciaram positivamente a produção de lipase, um planejamento fatorial 24 foi desenvolvido para avaliação das variáveis torta de soja, torta de mamona, glicerol e KH2PO4. A torta de soja foi a variável que mais influenciou a produção de lipase, seguida pelo glicerol. Um novo planejamento 22 composto central acrescido de pontos axiais foi então desenvolvido para otimizar as concentrações de torta de soja e glicerol e obter os maiores títulos de lipase. Os valores preditivos para a produção de lipases nas condições otimizadas e nas três unidades avaliadas foram 72,81 U/mL, 111,8 U/mg e 4892 U/gss e os experimentais obtidos foram de 76,57 ± 7,97 U/mL, 138,7 ± 0,34 U/mg e 4820 ± 248,8 U/gss. A lipase produzida teve atividade ótima em pH 8 e 55ºC, também foi estável entre 30 e 55ºC e em pH de 1 a 10, e apresentou tolerância de 25, 10 e 50% (v/v) em metanol, etanol e glicerol, respectivamente. Os íons Mn2+, Mg2+ e Ba2+ foram os ativadores mais significativos e os íons Fe3+, Cu2+ e Hg2+ foram os maiores inibidores da lipase livre de B. ribis EC-01. A lipase de B. ribis EC-01 hidrolisou todos os substratos testados, tendo afinidade pelo palmitato de p-nitrofenila. Dentre os suportes testados na imobilização desta lipase, o que proporcionou maior atividade específica em relação à enzima livre foi o Celite (1h a 5 ºC) com 72,7 %, seguido do suporte quitosana em pó ativada com 0,25 % de glutaraldeído (59,5 %). A produção de biodiesel utilizando a lipase de B. ribis EC-01 em sua forma livre alcançou rendimento de 6 %, enquanto que a imobilizada em Celite, 36 %. A lipase imobilizada em Celite teve atividade ótima em pH 8 e 55 ºC e foi estável em temperaturas de 40 a 55ºC e também estável nos solventes metanol, t-butanol, glicerol e hexano em concentrações de 50, 100, 50 e 100 % (v/v), respectivamente. A lipase imobilizada em Celite apresentou constante de desativação térmica (kd) menor que de sua forma livre. Na temperatura de 55 ºC, esta lipase imobilizada dobrou o seu tempo de meia vida (t1/2) em relação à livre e a 45 ºC o tempo de meia vida passou de 28 dias para 412 dias com a imobilização. A forma imobilizada da lipase de B. ribis EC-01 também foi capaz de hidrolisar os substratos testados sendo que a sua maior afinidade foi com o palmitato de p-nitrofenila. Esta lipase imobilizada em pasta de carbono também foi avaliada para potencial aplicação em biossensores. Portanto, o uso de tortas vegetais como a torta de soja é viável para a produção de lipases em condição de fermentação submersa, produzindo um catalisador estável, inclusive após a sua imobilização, sendo promissor para aplicações biotecnológicas.
By-products from processing vegetable oils such as oil-seed meals constitute cheap fermentation substrates for microbial production of lipases that can be applied to catalyze transesterification reactions for the synthesis of biodiesel. A factorial 24 statistical design was developed using the response surface methodology to evaluate lipase production by the ascomycete, Botryosphaeria ribis EC-01 under submerged fermentation by examining the influence of the concentrations of soybean and castor bean meals as well as glycerol and KH2PO4. Soybean meal was the variable most influencing lipase production followed by glycerol. A new central composite factorial 22 design was then developed that added two axial points to optimize the concentrations of soybean meal and glycerol to obtain the highest lipase titres. The predicted lipase titres under the optimal conditions and at three units evaluated were 72.81 U/mL, 111.8 U/mg and 4892 U/gds and the experimental data were 76.57 ± 7.97 U/mL, 138.7 ± 0.34 U/mg and 4820 ± 248.8 U/gds.The produced lipase has optimal activity at pH 8 and 55 ° C, and it was also stable between 30 and 55 °C and pH 1-10, and showed tolerance of 25, 10 and 50% (v/v) in methanol, ethanol and glycerol, respectively. The ions Mn2+, Mg2+ and Ba2+ were the most important activators and ions Fe3+, Cu2+ and Hg2+ were the most inhibitors B. ribis EC-01 lipase. B. ribis EC-01 lipase hydrolyzed all substrates having high affinity for p-nitrophenyl palmitate. Among the supports tested in the immobilization of this lipase Celite (1h at 5 ºC) provided higher specific activity compared to the free enzyme, which was 72.7%, followed by chitosan powder support activated with 0.25% glutaraldehyde (59.5 %). The production of biodiesel using B. ribis EC-01 lipase in its free form has reached 6% yield, whereas immobilized on Celite, 36%. The immobilized lipase on Celite has optimum activity at pH 8 and 55 °C and it was stable at temperatures between 40 to 55 °C, and also stable in solvents methanol, t-butanol, glycerol and hexane at concentrations of 50, 100, 50 and 100% (v/v), respectively. The lipase immobilized on Celite showed constant thermal deactivation (kd) smaller than its free form. At the temperature of 55 ° C this lipase doubled its half-life (t1/2) compared to free form and at 45 ° C the half-life increased from 28 days to 412 days with immobilization. The immobilized form of B. ribis EC-01 lipase was also able to hydrolyze the substrates while its high-affinity was for p-nitrophenyl palmitate. This lipase was also evaluated for potential application in biosensors immobilized on the carbon paste. Therefore, the use of vegetable pies like soybean cake is feasible for lipase production in submerged condition, producing a stable catalyst even after their immobilization being promising for biotechnological applications.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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