Análise estrutural de genes policetídeos sintases (pks) de Aspergillus niger

Autor: Lara Munique Ferracin
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2011
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UELUniversidade Estadual de LondrinaUEL.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: Os genes que codificam proteínas envolvidas no metabolismo secundário geralmente encontram-se agrupados um ao lado do outro, ditos em clusters. Estes clusters gênicos comumente contêm genes que codificam hidrolases, oxidases, metilases, proteínas reguladoras e proteínas de transporte que estão adjacentes a genes que codificam para policetídeos sintases (PKS) e peptídeos não-ribossomais sintases (NRPS). Devido os genes pks e nrps serem característicos de metabolismo secundário, um procedimento apropriado para encontrar clusters associados a um dado processo, é primeiramente buscar estes genes típicos e depois examinar as adjacências. Embora Aspergillus niger seja um fungo há muitos anos utilizado para obtenção de produtos destinados à indústria de alimentos, mais recentemente foi descrita a habilidade de algumas linhagens desta espécie em produzir micotoxinas, tais como ocratoxina A e fumonisina (FB2 e FB4). Nesta tese, análises de bioinformática foram aplicadas para inventariar genes pks de dois genomas de A. niger (CBS 513.88 e ATCC 1015) visando a identificação de clusters relacionados ao metabolismo secundário que sejam linhagem-específicos. A comparação in silico de 34 genes pks preditos na linhagem CBS 513.88 com os genes presentes no genoma da linhagem ATCC 1015 desta mesma espécie, revelou alta identidade de sequências de nucleotídeos para 31 deles (91%). No entanto, a linhagem CBS 513.88 possui três genes pks (An01g01130, An11g05940 e An15g07920) em que homólogos não são encontrados em ATCC 1015. Baseando-se em sequências de nucleotídeos de CBS 513.88 depositada no banco de dados do NCBI, pares de primers de PCR foram idealizados e usados na investigação destes genes únicos em 119 linhagens de A. niger coletadas de diferentes substratos e regiões geográficas. Amplicons dos genes pks An01g01130, An11g05940 e An15g07920 foram detectados, respectivamente, em 97%, 71% e 26% das linhagens. A identidade destes amplicons foi confirmada por sequenciamento. Devido um dos genes pks linhagem-específico (An15g07920) estar localizado em um cluster possivelmente envolvido na biossíntese de ocratoxina A, investigações adicionais acerca deste gene foram conduzidas. A capacidade de produção de ocratoxina A das 119 linhagens de A. niger foi avaliada. Um total de trinta e um isolados (26%) foi produtor desta micotoxina. Uma associação positiva entre a presença de amplicons correspondente ao gene An15g07920 e a capacidade das linhagens produzirem a referida toxina, foi claramente demonstrada. Dados de Southern blot confirmaram a associação entre a presença do gene An15g07920 e produção da ocratoxina A.
Genes associated with secondary metabolite biosynthesis are often clustered in filamentous fungi. These clusters generally harbor genes encoding for polyketide synthases (PKS) and nonribosomal peptide synthetases (NRPS) neighboring to ones encoding for hydrolases, oxidases, methylases, transporters, and regulatory proteins. As PKS and NRPS are characteristically related to with secondary metabolism, an appropriate approach to find a novel biosynthetic pathway is to explore genome sequences for those genes first and then investigating adjacent regions. Aspergillus niger is one of the most important microorganisms used for biotechnological purposes, however mycotoxin, (such as ochratoxin A and fumonisina FB2 e FB4) production in some strains from this species has been recently described. In this thesis, bioinformatic approaches were applied to the pks gene inventory of two A. niger genome (CBS 513.88 and ATCC 1015) aiming the identification of strain-specific gene clusters for secondary metabolism pathways. In silico comparison of 34 putative pks genes in Aspergillus niger CBS 513.88 versus A. niger ATCC 1015 genome reveled significant nucleotide identity for 31 of them (91%). A. niger CBS 513.88 harbors three putative pks genes (An01g01130, An11g05940 and An15g07920) for which nucleotide identity were not found in A. niger ATCC 1015. Based on the nucleotide sequence from A. niger CBS 513.88 deposited in the NCBI database primer pairs were designed and used in an attempt to amplify regions of the An15g07920 gene from 119 wild type A. niger strains obtained from different substrates and geographical regions. PCR amplification signal for the An01g01130, An11g05940 and An15g07920 pks genes were detected in only, respectively, 97%, 71% and 26% of the strains. The identities of these amplicons were confirmed by nucleotide sequencing. Because the cluster in which An15g07920 pks is located was annotated as a putative ochratoxin cluster, we concentrated our investigation on it. The ochratoxin A production capability by each of the strains here studied were assessed. In our sample, 26% (31/119) of the strains evaluated were able to produce OTA. A positive association between amplicon detection and the strains capability of ochratoxin producing were found. The realities of the PCR data were confirmed by Southern blot analyses, supporting a clear association between the An15g07920 pks gene and OTA phenotype.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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