EMC1 contribui para a malignidade em células de câncer de mama

Autor: Roberto Augusto Silva Molina
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2014
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Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPUniversidade de São PauloUSP.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: O câncer de mama é uma das principais causas de morte por câncer em mulheres em todo o mundo, apresentando-se como uma doença heterogênea composta por distintos subtipos associados a diferentes prognósticos clínicos, mas as bases moleculares que sustentam sua progressão tumoral ainda não estão completamente elucidadas. Evidências de estudos em larga escala apontam uma potencial participação da proteína EMC1 no desenvolvimento do câncer de mama, mas falham em avaliam seu papel específico na progressão e manutenção deste tipo de tumor. EMC1 faz parte de um complexo definido por dez proteínas presente no retículo endoplasmático denominado Endoplasmic Reticulum Membrane Complex, caracterizado recentemente com potencial papel no enovelamento e maturação de proteínas de membrana e na via secretória. Investimos deste modo na caracterização de EMC1 e no seu envolvimento com o câncer de mama. Utilizando um pequeno painel de linhagens tumorais de mama, mostramos por meio de qPCR que os níveis de RNAm de EMC1 estavam aumentados em linhagens consideradas mais agressivas. Duas linhagens tumorais de mama, MCF-7 e SKBR-3 foram utilizadas para expressão estável de EMC1 mediada pelo vetor plasmidial pcDNA3.1. Os efeitos foram notáveis apenas para a linhagem SKBR-3, que apresenta amplificação no locus HER-2, um receptor do tipo tirosina quinase da família EGFR envolvido em vias de invasão e proliferação celular. Observamos uma nítida alteração morfológica após a superexpressão de EMC1 nesta linhagem, sugerindo uma reprogramação para um fenótipo mesenquimal. As células adquiriram filopódios mais proeminentes e mostraram aumento em sua capacidade proliferativa e crescimento clonogênico, sob condições adesivas ou não, bem como aumento nas capacidades invasiva (transwell) e migratória (wound healing). Análises do ciclo celular por iodeto de propídeo indicaram um ligeiro aumento nas populações celulares nas fases S e G2/M em células superexpressando EMC1, corroborando os ensaios funcionais. Notamos também após a superexpressão de EMC1 um aumento na liberação de MMP-2, justificando o aumento na capacidade invasiva destas células. Os resultados dos ensaios funcionais comprovam as análises in silico realizadas nas quais identificamos uma correlação da expressão de EMC1 com proteínas envolvidas em funções no retículo endoplasmático e no processo de transição epitélio-mesenquimal. Avaliamos ainda o metabolismo celular quanto a funções mitocondriais como consumo de oxigênio utilizando um oxígrafo e quanto a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) através da marcação por DHE. A superexpressão de EMC1 levou à diminuição da respiração, ou seja, no consumo de oxigênio e também da produção de EROs, ao passo que os níveis de lactato foram aumentados, características associadas a maior malignidade de células tumorais de mama. Por fim, mostramos através de ensaio de tumorigênese in vivo utilizando camundongos nude que a superexpressão de EMC1 conduziu a formação de tumores mais agressivos e de maior volume. Em conjunto os dados sugerem um importante papel de EMC1 na progressão tumoral do câncer de mama, sobretudo na transição para estágios mais invasivos, servindo como potencial marcador diagnóstico e alvo para terapias futuras.
Breast cancer is a leading cause of cancer death in women worldwide. It presents as a heterogeneous disease composed of distinct subtypes associated with different clinical prognoses, but the molecular basis underlying their tumor progression are not yet fully comprehended. Evidence from large-scale studies suggests a potential involvement of EMC1 protein in the development of breast cancer, but fail to assess its specific role in the progression and maintenance of this type of tumor. EMC1 is part of a protein complex composed of ten different subunits associated to the endoplasmic reticulum (ER) and recently proposed to play a potential role in the folding and maturation of membrane proteins in the secretory pathway. Thus, our aim here was to do a functional characterization of EMC1 in breast cancer. Using a small panel of breast cancer cell lines, we showed higher EMC1 mRNA expression levels in the most aggressive cell lines, by qPCR. Two breast tumor cell lines, MCF - 7 and SKBR -3 were used for stable expression of EMC1 mediated by the plasmidial vector pcDNA3.1. The effects were remarkable only for the SKBR-3 cell line, which carries an amplification of the HER-2 locus, a tyrosine kinase receptor of the EGFR family, involved in cell proliferation and invasion. We observed a clear morphological change after overexpression of EMC1 in this cell line, suggesting a reprogramming to a mesenchymal phenotype. The cells acquired more prominent filopodia and showed an increase of their proliferative capacity and clonogenic growth upon adhesive and non-adhesive conditions, as well as an increase of invasive (collagen-coated transwell) and migratory (wound healing) properties. Analysis of the cell cycle by propidium iodide showed a slight increase in the cell population in S phase and G2/M for EMC1-overexpressing cells, corroborating other functional assays. Also, EMC1-overexpressing cells showed an increase in the release of MMP-2, which could explain the increase in the invasive capacity of these cells. The results of the functional assays confirm the in silico analysis performed in which we identified a correlation between the EMC1 expression with proteins involved in functions in the endoplasmic reticulum and in the epithelial-mesenchymal transition. We also evaluated the cellular metabolism and mitochondrial functions such as oxygen consumption using an oxygraph and the generation of reactive oxygen species (ROS) with DHE dye. Overexpression of EMC1 led to decreased respiration, i.e. oxygen consumption and also ROS production whereas lactate was increased, characteristics associated with increased malignancy of breast tumor cells. Finally, we show through in vivo tumorigenesis assay using nude mice that overexpression of EMC1 led to formation of more aggressive tumors. Together the data suggest an important role of EMC1 in tumor progression of breast cancer, especially in the transition to more invasive stages, serving as a potential prognostic marker and target for future therapies.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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