Preparação bioquímica para caracterização molecular e estrutural do RNA vírus LRV1-4

Autor: Érika Chang de Azevedo
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2015
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPUniversidade de São PauloUSP.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: O vírus de Leishmania 1-4 ( do inglês Leishmania RNA virus 1-4 ou LRV1-4) é um vírus da família Totiviridae, e que possui capsídeo icosaédrico e RNA dupla-fita que codifica duas proteínas (proteína capsidial e RNA polimerase). Dados recentes indicam o envolvimento do LRV1-4 na patogênese de Leishmania no hospedeiro humano, tornando seu estudo de fundamental importância para o entendimento dessa doença e de seu papel na relação parasito-hospedeiro. Há relatos sobre a purificação do vírus a partir do seu hospedeiro natural (Leishmania guyanensis) e a partir de sistemas de expressão heteróloga. Este trabalho tem por objetivo estabelecer os métodos de purificação para posteriores estudos estruturais por Microscopia Eletrônica de Transmissão por Contraste Negativo (NS-TEM) e por Crio-Microscopia Eletrônica (Cryo-EM). Os estudos aqui propostos irão permitir a construção de um modelo estrutural do capsídeo do LRV1-4 e sua identificação correta dentre os totivírus. Além das contribuições ao conhecimento da biologia/patogenia do LRV1-4 este estudo representa a primeira caracterização estrutural de um capsídeo viral realizada no Brasil, e assim um avanço importante para a área de virologia e biologia estrutural no pais. Foram realizadas ultracentrifugações biológicas, utilizando gradientes de sacarose, para a purificação do vírus a partir do extrato celular de L. guyanensis. As frações que apresentaram RNA viral foram analisadas por Microscopia Eletrônica de Transmissão (Campinas LNNano CNPEM). Além disso, foram realizadas tentativas de expressar a proteína do capsídeo (ORF2) em Leishmania tarentolae e Escherichia coli. Foram também realizados esforços para a obtenção de anticorpos a partir de peptídeos sintetizados após análise computacional da sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo. As amostras obtidas a partir do hospedeiro natural do vírus se apresentaram heterogêneas quando analisadas por NS-TEM, de modo que não foi possível a realização de uma análise estrutural. Porém, a presença de partículas do tamanho esperado para o vírus em amostras em que foi detectado o RNA viral indicam que são necessários esforços para obtenção de uma amostra de maior pureza e homogênea. Além disso, não foi possível obter a proteína do capsídeo nos sistemas de expressão heteróloga. A presença de 25 resíduos de cisteína pode estar levando a proteína à degradação rápida em bactéria. Os experimentos de expressão em células de Leishmania ainda não foram conclusivos. Foi obtido um anticorpo anti-peptídeo que reconhece a proteína do capsídeo, tornando possíveis experimentos como imunolocalização e imunoprecipitação do vírus.
The Leishmania RNA virus 1-4 (LRV1-4) belongs to the Totiviridae family. It has an icosahedral capsid and a double-strand RNA encoding two proteins (capsid protein and RNA polymerase). Recent data indicate the involvement of LRV1-4 in the pathogenesis of Leishmania in the human host, making their study of fundamental importance for the understanding of this disease and its role in host-parasite relationship. There are reports on the purification of the virus from its natural host (Leishmania guyanensis) and from the same heterologous expression systems such as Escherichia coli.This work aims to stablish purification methods for further structural studies by Negative Stain Transmission Microscopy (NS-TEM) and Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM). The studies proposed here will allow the construction of a structural model of the coat protein of LRV1-4 and their correct identification amongst the Totiviridae. In addition to the contributions to the knowledge of the biology and pathogenesis of LRV1-4, this study represents the first structural characterization of a viral capsid held in Brazil and thus an important step forward for the field of virology and structural biology in the country. Sucrose for virus purification gradients were performed from the cell extract of L. guyanensis. Fractions that showed viral RNA were analised by Transmission Electron Microscopy (Campinas LNNano - CNPEM). Furthermore, attempts have been made to express the capsid protein (ORF2) in Leishmania tarentolae and Escherichia coli. There has also been made efforts to obtain antibodies from peptides synthesized accordingly to the computer analysis of the amino acid sequence of the capsid protein. The samples obtained from the natural host of the virus showed a heterogeneous distribution of particles when examined by NS-TEM so that it was not possible to perform a structural analysis. However, the presence of particles of the size expected for the virus particles in samples where the viral RNA was detected indicate that efforts are necessary to obtain a more homogeneous and pure sample. Moreover, it was not possible to obtain the capsid protein in heterologous expression systems. The presence of 25 cysteine residues could have led to the protein rapid degradation in the bacteria host. The expression experiments in Leishmania cells were not yet conclusive. It was also possible to obtain an anti-peptide antibody recognizing the capsid protein, enabling immunoprecipitation and immunolocalization experiments.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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