Identificação de fatores de transcrição e sinais celulares que regulam a expressão do gene cspC em Caulobacter crescentus.

Autor: Juliana da Silva Santos
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2012
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Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPUniversidade de São PauloUSP.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: As proteínas de choque frio pertencem a uma família de proteínas com um domínio altamente conservado, denominado domínio de choque frio (CSD). Estão envolvidas em vários processos celulares, incluindo adaptação a baixas temperaturas, estresse nutricional e fase estacionária. Em C. crescentus, uma α-proteobacteria não patogênica, as proteínas CspC e CspD apresentam dois CSDs e seus níveis aumentam apenas durante a fase estacionária. Este trabalho tem como objetivo determinar os fatores de transcrição e sinais celulares envolvidos na regulação do gene cspC em C. crescentus. No presente trabalho, foi realizada a varredura de uma biblioteca de 4000 clones mutados pela inserção do transposon Tn5, onde foram identificados sete mutantes com expressão reduzida de cspC: CCNA03569 (proteína hipotética); CCNA02510 (deacetilase de oligossacarídeos); CCNA01594 (metiltransferase da proteína ribossomal L11); CCNA02186 (pequena subunidade da acetato lactato sintase); CCNA00084 (fosforibosil aminoimidazol carboxamida formiltransferase/ IMP ciclohidrase); CCNA03616 (sulfito redutase dependente de NADPH) e CCNA01448 (frutose-1,6-bisfosfatase). Através de ensaios de expressão na presença de um meio condicionado, verificou-se que cspC e cspD aparentemente não são induzidos em resposta ao aumento de densidade populacional. O fenótipo do mutante cspC na fase estacionária foi avaliado em relação a sua resistência a estresse oxidativo, e vimos que a linhagem DcspC é altamente sensível ao peróxido de hidrogênio e a superóxidos, mas não é sensível a hidroperóxido orgânico. A ausência de cspC provavelmente é compensada por dps, já que a expressão deste gene aumenta no mutante DcspC. Por outro lado, a transcrição de katG diminui, mas as atividades de KatG e SodB não são afetadas no mutante cspC. Em condições de estresses provocados por peróxido de hidrogênio, sacarose e sal a expressão de cspC não é afetada. Os fatores sigmas SigT e SigU e o regulador de transcrição Fur não estão envolvidos na regulação de cspC, mas no mutante DsigJ a expressão de cspC aumenta, e no mutante DoxyR ela é diminuída. Foi verificado também que cspC apresenta uma autoregulação positiva, que pode se dar por meio de estabilização de seu próprio mRNA.
The cold shock proteins belong to a family of proteins presenting a highly conserved domain, called cold shock domain (CSD). They are involved in various cellular processes, including adaptation to low temperature, nutritional stress, cell growth and stationary phase. In C. crescentus, a non-pathogenic α-proteobacteria, the cold shock proteins CspC and CspD have two CSDs and they are induced during stationary phase. This study aims to determine the transcription factors and cellular signals involved in cspC gene regulation in C. crescentus. In the present study we scanned a library of 4000 mutant clones with the Tn5 transposon, from which seven mutants were identified presenting reduced expression of cspC: CCNA03569 (hypothetical protein); CCNA02510 (polysaccharide deacetylase); CCNA01594 (ribosomal protein L11 methyltransferase); CCNA02186 (acetolactate synthase 3 regulatory subunit); CCNA00084 (bifunctional phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase); CCNA03616 (sulfite reductase (NADPH)) e CCNA01448 (fructose 1,6-bisphosphatase II). Expression assays in the presence of a conditioned medium, showed that cspC and cspD are apparently not induced in response to increased cell density. The phenotype of the mutant cspC was evaluated as to oxidative stress resistance in the stationary phase. The results showed that the DcspC strain is highly sensitive to hydrogen peroxide and superoxide but is not sensitive to organic hydroperoxide. The absence of cspC probably is compensated by dps, since the expression of this gene is increased in DcspC strain. In contrast, the transcritpion of katG is decreased, but the activities of KatG and SodB are not affected in the cspC mutant. Under conditions of stress caused by hydrogen peroxide, sucrose or salt, cspC expression is not affected. The sigma factors sigmas SigT and SigU and transcription regulator Fur are not involved in the regulation of cspC, but cspC expression is increased in DsigJ and decreased in DoxyR strains, respectively. It was also determined that cspC shows a positive autoregulation, which may occur via stabilization of its own mRNA.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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