Utilização do produto Allprotect Tissue Reagent® na estabilização do DNA extraído de tecidos dentais humanos em diferentes condições de armazenamento

Autor: Andrea Sayuri Silveira Dias Terada
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2013
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPUniversidade de São PauloUSP.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: A metodologia genético-molecular destaca-se como uma técnica apurada para os processos de identificação humana e, dentre as fontes de evidência biológica, o uso de elementos dentais é de grande interesse. A manutenção da integridade do material enviado ao laboratório é imprescindível para o sucesso dos resultados obtidos e uma das principais dificuldades encontradas é com relação ao armazenamento da amostra, que geralmente é realizado em baixas temperaturas. O presente trabalho avaliou a eficácia do produto Allprotect Tissue Reagent® (Qiagen, Hilden, Germany) na estabilização do DNA extraído de tecidos dentais humanos armazenados em diferentes condições. Para tal, foram utilizados 165 elementos dentais, os quais foram distribuídos em dois grupos distintos: dente íntegro e tecido pulpar dental isolado. As amostras foram armazenadas com ou sem a utilização do referido produto, variando o período de tempo (1, 7, 30 e 180 dias) e temperatura (ambiente e refrigeração). Além desses grupos, foi formado um grupo controle positivo composto por cinco elementos dentais armazenados a -20ºC durante 180 dias. Após o armazenamento foi realizada extração do DNA, eletroforese em gel de agarose, quantificação do DNA genômico por PCR Tempo Real e análise de fragmentos de 37 amostras. Os fragmentos de 32 amostras que representavam cada condição possível e as cinco amostras do grupo controle positivo foram analisados, a fim de verificar quatro marcadores pré-selecionados. O gel de agarose mostrou evidências da presença de DNA genômico. Os valores da quantificação foram analisados estatisticamente pelos testes Kruscal-Wallis e Mann-Whitney. Os resultados mostraram valores que variaram de 0,01 a 10246,88ng/L de DNA. Houve diminuição da concentração de DNA nas amostras de dente armazenadas em temperatura ambiente por 30 e 180 dias em relação às que ficaram armazenadas por 1 e 7 dias. Além do fator tempo, a temperatura também influenciou na concentração de DNA, sendo maior nos dentes que ficaram por 30 dias e na polpa dental mantida por 180 dias, quando refrigerados. Em relação à utilização do produto Allprotect Tissue Reagent® (Qiagen, Hilden, Germany), o mesmo mostrou diferença significativa na estabilização dos dentes que foram armazenados em temperatura ambiente durante 30 e 180 dias. A análise de fragmentos foi possível nas 37 amostras selecionadas, independente da quantidade de DNA, confirmando a importância das reações de amplificação e da análise de STR utilizando método automático. Conclui-se que a utilização do produto Allprotect Tissue Reagent® (Qiagen, Hilden, Germany) mostrou diferença significativa na estabilização do DNA das amostras de dentes íntegros armazenadas em temperatura ambiente durante 30 e 180 dias, enquanto que nas demais condições testadas, os resultados não evidenciaram justificativas para o uso do produto.
The genetic-molecular methodology stands out as an accurate technique for human identification process and among the sources of biological evidence, the use of teeth is of great interest in Forensic Dentistry. Maintaining integrity of the material sent to laboratory is essential for success of the analysis, and one of the main difficulties is related to sample storage, which is usually carried out at low temperatures. This study evaluated the effectiveness of the Allprotect Tissue Reagent® (Qiagen, Hilden, Germany) in stabilizing DNA extracted from human dental tissues stored under different conditions. In this study were used 165 teeth, distributed in two groups: intact teeth and isolated pulp tissue. The samples were stored with or without the product and varying the storage time (1, 7, 30 and 180 days) and temperature (room temperature and under refrigeration). In addition to these groups, was formed a positive control group, composed by five teeth, which was stored at -20ºC for 180 days. After storage, DNA extraction, electrophoresis on agarose gel and genomic DNA quantification by Real-Time PCR and fragments of 37 samples were performed. The fragments of 32 samples representing every possible condition and five positive control group samples were analyzed to verify four pre-selected markers. The agarose gel showed evidences of genomic DNA presence. Quantification results were statistically analyzed with the tests Kruscal-Wallis and Mann-Whitney. Quantification results showed values ranging from 0.01 to 10,246.88 ng/L of DNA. There was a decrease in DNA concentration in stored tooth samples at room temperature for 30 and 180 days compared to those stored for 1 and 7 days. Besides the time factor, temperature also influenced the DNA concentration, being higher in teeth that remained for 30 days and in tooth pulp maintained for 180 days, under refrigeration. Regarding the use of Allprotect Tissue Reagent® (Qiagen, Hilden, Germany) it showed a significant difference in stabilization of stored teeth at room temperature for 30 and 180 days. The analysis of fragments was possible in 37 selected samples, regardless of the DNA quantity variation, confirming that amplification reactions and STR analysis using automated methods provides good results. It was concluded that the use of Allprotect Tissue Reagent® (Qiagen, Hilden, Germany) showed a significant difference in stabilizing DNA samples of intact human teeth stored at room temperature for 30 and 180 days, while in the other test conditions the results showed no justification for using this product.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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