Desenvolvimento de modelos animais de terapia gênica para o hormônio de crescimento utilizando queratinócitos transduzidos e injeção direta de DNA plasmidial

Autor: Nélio Alessandro de Jesus Oliveira
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2010
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPUniversidade de São PauloUSP.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P
Keratinocytes are very attractive cells for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. In this study, retrovirally transduced keratinocytes with the mouse growth hormone (mGH) gene underwent a treatment for adhesion to collagen and clonal analysis, in order to enrich in stem cells the keratinocyte population. The main result was an in vitro increase of cell viability for treated keratinocytes, which should result in an increase of the in vivo sustainability of hormone secretion, when implanting organotypic cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice. A model for in vivo gene therapy based on the electrotransfer of human growth hormone (hGH)-coding naked DNA in the exposed quadriceps muscle of dwarf (lit/lit) and immunodeficient dwarf (lit/scid) mice was also utilized. Electroporation conditions were optimized, setting up eight 50-V pulses of 20 ms at a 0.5 s interval, using a plasmid containing the ubiquitin C promoter and the genomic hGH sequence. Administration of a single dose of 50 g of this plasmid led, for the first time in the literature, to sustained levels of circulating hGH of the order of 1.5-3 ng/ml, up to 60 days. The DNA-treated animals presented a highly significant weight gain (P
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