Interações da porfirina aniônica meso-tetrakis-4-fenilsulfonato (TPPS4) e da albumina de soro bovino (BSA) com surfactantes catiônicos

Autor: Diógenes de Sousa Neto
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2007
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Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPUniversidade de São PauloUSP.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: A interação da porfirina aniônica meso-tetrakis (4-fenilsulfonato) (TPPS4) com modelos simples de membrana biológica foi investigada utilizando as técnicas de ressonância paramagnética eletrônica (RPE) e de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS, do inglês small-angle X-ray scattering). Os modelos biomiméticos empregados no presente trabalho são constituídos de micelas catiônicas formadas a partir do surfactante catiônico cloreto de cetiltrimetilamônio (CTAC). Os experimentos de RPE e SAXS foram realizados a temperatura ambiente e nos pHs 4,0 e 9,0 a fim de verificar se o estado de protonação das porfirinas altera a natureza das interações com os sistemas micelares. As análises de RPE mostraram um comportamento similar para os marcadores de spin 5-DSA e 16-DSA; ou seja, a adição de porfirina às micelas catiônicas é seguida por uma redução da mobilidade de ambos os marcadores, principalmente para concentrações maiores de porfirina. Este comportamento foi atribuído ao efeito de empacotamento das micelas para o qual os resultados obtidos dos dados de SAXS parecem sustentar esta interpretação. Entretanto, a polaridade monitorada pelo marcador de spin 5-DSA mostrou ser praticamente a mês ma para todas as concentrações de porfirina e em ambos os valores de pH, sugerindo que o estado de protonação da TPPS4 não altera a natureza das interações envolvidas com a região das cabeças polares das micelas. Por outro lado, o marcador de spin 16-DSA mostrou uma pequena redução de polaridade para maiores concentrações de porfirina, principalmente em pH 4.0. Isso indica que a interação da porfirina também ocorre nas regiões hidrofóbicas das micelas. De fato, os ajustes dos dados de SAXS permitiram concluir que as distorções na forma de linha das curvas em função da concentração de porfirina estão associadas basicamente a uma redução do raio parafínico da micela de CTAC (parâmetro Rpar). Contudo, nenhuma mudança significativa na espessura da camada polar (parâmetro σpol) ou na sua densidade (parâmetro ρpol) foi observada. As curvas deSAXS de melhor ajuste foram obtidas assumindo as micelas de CTAC como elipsoides prolatos, onde a razão axial (parâmetro v ) não mostrou mudanças significativas para a faixa de 2-10 mM de TPPS4 e para os valores de pH estudados. A técnica de RPE também foi utilizada para monitorar a interação da albumina de soro bovino (BSA, do inglês bovine serum albumin) com o surfactante catiônico CTAC em pH 7,0. Marcadores de spin derivados do ácido esteárico (5-DSA e 16-DSA) ligados aos sítios de ligação de alta afinidade da BSA revelaram que na presença de surfactante os espectros de RPE são compostos de duas populações. Análises espectrais foram realizadas através do programa de simulação NLSL (do inglês, nonlinear leastsquares),o qual permitiu obter a difusão rotacional e a contribuição de cada componente nos espectros de RPE assim como avaliar a polaridade do ambiente onde os radicais nitróxidos estão estão dissolvidos. Os valores do tempo de correlação rotacional, τ,indicaram que a componente 1 apresenta um estado de mobilidade mais restrito devidoaos marcadores de spin estarem em contato com a proteína; a componente 2 menosimobilizada surge dos marcadores de spin localizados nas estruturas micelares. Para o 5-DSA, uma significante imobilização deste marcador permanece mesmo para altasconcentrações de surfactante, o qual é consistente com sua maior constante de ligaçãoquando comparado ao 16-DSA. O aumento da concentração de surfactante conduz a umaumento nos níveis de movimento da componente 1 seguido por uma redução da fraçãode marcadores de spin associado à esta componente
Electron paramagnetic resonance (EPR) and small angle X-ray scattering (SAXS) were used to investigate the interaction of the meso-tetrakis (4-sulfonatophenyl) porphyrin (TPPS4) with simple biological membrane models. In the present work, cationic cethyltrimethylammonium chloride (CTAC) micelles were used as mimetic models. RPE and SAXS experiments were performed at room temperature and at pHs 4.0 and 9.0 in order to evaluate whether the protonation state of the TPPS4 affects its interaction with the cationic micelle. EPR analysis showed a similar behavior for both spin labels 5-DSA and 16-DSA, i.e., the addition of porphyrin to the cationic micelles is followed by a reduction of mobility state for both spin labels, mainly at higher porphyrin concentrations. This behavior has been associated to the micellar packing effect, which seems to be supported by SAXS data. The polarity monitored by the spin label 5-DSA was practically the same in the whole porphyrin concentration range and pH values, suggesting that the protonation state of porphyrin did not contribute significantly for its interaction with cationic micelles. On the other hand, the spin label 16-DSA senses a slightly more hydrophobic environment as a function of porphyrin concentration, especially at pH 4.0. These findings indicate that the interaction of porphyrin also occurs at the hydrophobic core of cationic micelles. Indeed, the data obtained from the best fittings for SAXS curves allowed to conclude that the incorporation of porphyrin by the micelles is associated essentially to a shrinking of the paraffinic shortest semi-axis (R par parameter). Nevertheless, the polar shell thickness (σpol) and the electron density (Ρpol) parameters were practically unaltered in the whole porphyrin concentration range. The best-fit SAXS curves were achieved assuming for CTAC micelles a prolate ellipsoidal shape, where the axial ratio (v value) did not exhibit significant changes over the range 2-10 mM of TPPS4 and studied pH values. EPR technique was also used to monitor the interaction of bovine serum albumin (BSA) with cationic cethyltrimethylammonium chloride (CTAC) at pH 7.0. Spinlabeled derivatives of stearic acids (5-DSA and 16-DSA) bound to high-affinity binding sites of BSA revealed that in the presence of surfactant the EPR spectra are composed of two label populations. Spectral analysis was performed using the nonlinear leastsquares (NLSL) simulation program, which allows one to obtain the rotational diffusion rate and the contribution of each component in the EPR spectra as well as to evaluate ix environment polarity where the nitroxides are localized. The values of rotational correlation time, τ, indicated that component 1 displays a more restricted mobility behavior due to spin labels contacting the protein; the less immobilized component 2 arises from label localization in the bulk of micelles. For 5-DSA, a significant immobilization of probes remains even at higher surfactant concentrations, which is consistent with its higher binding constant as compared to 16-DSA. The increase of surfactant concentration leads to the increase in motional levels of component 1 followed by a reduction of this fraction of spin labels
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