Estratégias para a criopreservação de células tronco mesenquimais de tecido adiposo bovino

Autor: Lenoch, Camila Yamaguti
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2015
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UDESCUniversidade do Estado de Santa CatarinaUDESC.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA160.pdf: 837445 bytes, checksum: f1dbe7c23f22405d7f87344ec22703cc (MD5) Previous issue date: 2015-03-30
The mesenchymal stem cells are a great promise for the treatment of many both congenital as acquired diseases. However, when they are subject to continuous cultivation in the laboratory, the risks of contamination and genetic mutations increase, being necessary to keep them at cryogenic temperatures. For this, the use of cryoprotectant substances is indispensable. The DMSO is the preferred cryoprotector, but some studies claim that it can induce the differentiation of stem cells into neuronal cells, as well as having high toxicity at room temperature. Therefore, the aim of this study was to test alternative cryoprotectants to DMSO for cryopreservation of mesenchymal stem cells and compare their efficiency. For this, these cells were isolated from bovine adipose tissue by enzymatic digestion with collagenase 0.075% and placed in DMEM + 10% FBS culture medium at 37ºC with 5% of CO2. Then, the cells were frozen at a concentration of 106 cells/mL in DMEM + 10% FBS with three different treatments: (1) 10% ethylene glycol (EG), (2) 10% propylene glycol (PG) and (3) 10% dimethyl sulfoxide (DMSO). A part of mesenchymal stem cells were maintained in culture for use as controls in the tests performed. After stay for, at least, 48 hours in a liquid nitrogen cylinder, they were thawed in a water bath at 37ºC, determined the immediate cell survival by the exclusion of dead cells by the staining with Trypan blue 0.4% method and performed the cell growth curve and the population doubling time test (PDT). Was also done the cell viability test using the WST-1 reagent and determined the differentiation capacity of these cells in cells of bone and adipose tissues. The results were analyzed using the SAS statistical package, by GLM procedure, adopting a 5% significance level. There was no statistical difference between treatments with EG (72.9%) and PG (71.7%) about the immediate cell survival, however DMSO (86.4%) had a significantly higher result than the others. The three cryoprotectants showed no statistical difference among them in the formation of the cell growth curve, however, all were lower than the not cryopreserved control. As the PDT test, there was no significant difference among the three treatments (EG: 28 h; PG: 26.7 h; DMSO: 27.2 h), but all of them had a doubling time of their populations statistically higher than the control (21.3 h). The cell viability, through the WST-1 reagent, of the cells cryopreserved with EG, PG and DMSO were respectively 66.65%, 71.42% and 83.62%. PG did not differ statistically from the other cryoprotectants, but the DMSO showed a significant difference from the EG. And both cells subjected to three treatments as those used as controls were able to differentiate into cells of bone and adipose tissues. It follows therefore that cryopreservation influences in the cell survival, cell multiplication rate and cell viability, but still can be used to store the mesenchymal stem cells, because the damage caused don t make them unviable. And both EG and PG may be used as an alternative to DMSO for the cryopreservation of these cells, since they presented technically viable results
As células tronco mesenquimais representam uma grande promessa para o tratamento de inúmeras doenças tanto congênitas quanto adquiridas. Porém, quando submetidas ao cultivo contínuo em laboratório, os riscos de contaminações e de mutações genéticas aumentam, sendo necessário então mantê-las em temperaturas criogênicas. Para isso, é imprescindível o uso de substâncias crioprotetoras. O DMSO é o crioprotetor de eleição, porém alguns trabalhos afirmam que este pode induzir a diferenciação das células tronco em células neuronais, além de apresentar alta toxicidade em temperatura ambiente. Portanto, o objetivo deste estudo foi testar crioprotetores alternativos ao DMSO para a criopreservação das células tronco mesenquimais e comparar a eficiência dos mesmos. Para tanto, estas células foram isoladas, a partir de tecido adiposo bovino, através da digestão enzimática com colagenase a 0,075% e colocadas em meio de cultivo DMEM + 10% SFB a 37ºC com 5% de CO2. Em seguida, as células foram congeladas na concentração de 106 células/mL em DMEM + 10% SFB com três tratamentos diferentes: (1) 10% Etilenoglicol (EG), (2) 10% Propilenoglicol (PG) e (3) 10% Dimetilsulfóxido (DMSO). Uma parte das células tronco mesenquimais foi mantida em cultivo para ser utilizada como controle nos testes realizados. Após permaneceram por, pelo menos, 48 horas em botijão de nitrogênio líquido, foram descongeladas em banho-maria a 37ºC, determinada a sobrevivência celular imediata através do método de exclusão de células mortas por coloração com azul de Tripan a 0,4% e realizados a curva de crescimento celular e o teste de Population Doubling Time (PDT). Também foi feito o teste de viabilidade celular através do reagente WST-1 e determinada a capacidade de diferenciação destas células em células dos tecidos ósseo e adiposo. Os resultados foram analisados pelo pacote estatístico SAS, por meio do procedimento GLM, adotando-se um nível de significância de 5%. Não houve diferença estatística entre os tratamentos com EG (72.9%) e PG (71,7%) quanto a sobrevivência celular imediata, entretanto o DMSO (86,4%) apresentou um resultado significativamente superior em relação aos demais. Os três crioprotetores não demonstraram diferença estatística entre si na formação da curva de crescimento celular, porém, todos foram inferiores ao controle não criopreservado. Quanto ao PDT, também não houve diferença significante entre os três tratamentos (EG: 28 h; PG: 26,7 h; DMSO: 27,2 h), mas todos apresentaram um tempo de duplicação de suas populações estatisticamente maior do que o controle (21,3 h). A viabilidade celular, através do reagente WST-1, das células criopreservadas com EG, PG e DMSO foram, respectivamente, 66,65%, 71,42% e 83,62%. O PG não diferiu estatisticamente dos demais crioprotetores, mas o DMSO apresentou diferença significativa em relação ao EG. E tanto as células submetidas aos três tratamentos como as utilizadas como controle conseguiram se diferenciar em células dos tecidos ósseo e adiposo. Conclui-se, portanto, que a criopreservação influencia na sobrevivência, na taxa de multiplicação e na viabilidade celular, mas mesmo assim pode ser utilizada para armazenar as células tronco mesenquimais, já que os danos causados não inviabilizam as mesmas. E tanto o EG como o PG podem ser utilizados como uma alternativa ao DMSO na criopreservação destas células, pois durante os experimentos realizados apresentaram resultados tecnicamente viáveis
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