Purificação e caracterização de enterohemolisina produzida por Escherichia coli enteropatogenicas

Autor: Catani, Cleide Ferreira
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 1999
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UnicampUniversidade Estadual de CampinasUNICAMP.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: Orientador: Tomomasa Yano
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
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As enterohemolisinas (EHly) foram inicialmente detectadas em amostras de Escherichia co/i enteropatogênicas clássicas (EPEC), isoladas a partir de fezes de crianças com diarréia, sendo posteriormente detectada em amostras de E. co/i isoladas de animais. Esta hemolisina, diferentemente da a-hemolisina, não é liberada espontaneamente no meio de cultivo, sendo necessária sua extração da célula bacteriana. Entre os métodos de extração utilizados, a sonicação mostrou ser o método mais eficiente para a liberação da enterohemolisina. Para a detecção da atividade hemolítica, os diferentes materiais a serem testados foram incubados a 37°C por lh, em microplacas ou em tubos, com 1% de eritrócitos de carneiro lavados com tampão PBS. A amostra padrão de E. co/i C3888 foi utilizada para a produção e purificação da enterohemolisina. Esta cultura foi cultivada em meio TSB, acrescido de quelante de ferro EDDA, por 22 horas em shaker a 37°C. Após o cultivo, a cultura foi sonicada e precipitada com sulfato de amônio com 60% de saturação. O material precipitado foi cromatografado em coluna de DEAE FastFlow. As frações com atividade hemolítica foram recromatografadas em coluna de exclusão molecular Superdex 200 e posteriormente em coluna Mono Q no sistema HPLC. A fração com atividade hemolítica obtida da coluna Mono Q apresentou apenas uma banda de 60kDa em gel de SDS-P AGE. No processo de purificação foi obtido um aumento na atividade específica de 2800 vezes, e aproximadamente 100 vezes na atividade relativa. A atividade da EHly se manteve estável por diversos meses no sonicado de cultura, quando este foi mantido a baixas temperaturas (-20°C e -70°C). Entretanto, não foi possível manter a atividade da hemolisina pura nos processos finais de purificação. Apesar da utilização de três diferentes métodos de inoculação em coelhos, para a obtenção de antissoro específico anti-enterohemolisina, não foram obtidos resultados satisfatórios nos testes de neutralização realizados, já que os títulos de soroneutralização obtidos foram os mesmos com soros pré e pós-imunização. Em testes com diferentes culturas celulares, a enterohemolisina semi-purificada foi citotóxica para as culturas de células Hep-2, HeLa, Caco-2, Vero, MDBK e 3T3, com arredondamento celular e descolamento do tapete. As células CHO apresentaram um efeito citopático, com alongamento das células e aparente condensação do núcleo. Nos ensaios com camundongos, não foi observado letalidade ou toxicidade nos animais adultos ou nos recém-nascidos testados
Enterohaemolysins (EHly) were ftrst detected in classical enteropathogenic Escherichia coZi strains (EPEC), isolated from feces of infants with diarrhea, and also detected in strains isolated from animaIs. Differring from a-haemolysin, EHly is not spontaneously released to culture medium. Sonication was the most efficient method to extract EHly. In order to detect haemolitic activity, the material was incubated for lh at 37°C in microplates or in tubes, with 1 % sheep erytrocytes, washed with PBS buffer. E. coZi strain C3888 was used to carry out production and puriftcation trials. Bacteria was cultivated in TSB medium with EDDA iron chelant, for 22h at 37°C. The cells were sonicated and the pellet submitted to cromatography in DEAE Fast-Flow column. The fractions that showed 8;ctivity were applied to Superdex-200 and Mono Q HPLC columns. The fraction with haemolitic activity obtained from Mono Q cromatography showed just one 60kDa band in SDS-P AGE electrophoresis gel. Increases of 2800 times in specrnc activity and aproximately 100 times in relative activity were obtained. The activity remained stable for several months in sonicated material when it was kept at low temperatures (-20°C to -70°C). However, it was not possible. to maintain the activity of pure haemolysin in the final purification procedures. Neutralization tests with specific anti-EHly antiserum did not present satisfactory results, despite the three different inoculation methods we tested in rabbits. Titles obtained with pre- and post-immunized sera were the same. In tests with different cell cultures, semipurified EHly proved to be citotoxic to Hep-2, HeLa, Caco-2, Vero, MDBK and 3T3 cells, showing cell rounding and detachment of the cell layer. CHO cells presented a cytopathic effect, with elongation and apparent condensation of the nuclei. No lethality or toxicity were observed in tests carried out in mice
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Ciências
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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