Desenvolvimento de uma biblioteca de enzimas a partir de metagenoma de solo = Library generation for biomass conversion enzymes from soil metagenome
| Autor: | Alvarez, Thabata Maria, 1986 |
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| Jazyk: | portugalština |
| Rok vydání: | 2013 |
| Předmět: | |
| Zdroj: | Repositório Institucional da UnicampUniversidade Estadual de CampinasUNICAMP. |
| Druh dokumentu: | Doctoral Thesis |
| Popis: | Orientador: Fabio Marcio Squina Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Made available in DSpace on 2018-08-23T12:41:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarez_ThabataMaria_D.pdf: 22982311 bytes, checksum: 1bc2a260df2bfab4948ffb299f13a63f (MD5) Previous issue date: 2013 Devido à necessidade do desenvolvimento de fontes de energias renováveis é de grande interesse a descoberta de novas enzimas envolvidas na desconstrução da parede celular vegetal para a produção de bicombustíveis. A metagenômica é uma poderosa ferramenta para a descoberta de novos genes em comunidades microbianas que não são passíveis de cultivo pelas técnicas tradicionais. Neste contexto, o objetivo desta tese foi o desenvolvimento de estratégias metagenômicas para prospecção de novas enzimas atuantes na degradação da biomassa vegetal no metagenoma de solo de canavial bem como a caracterização funcional das mesmas. A biblioteca metagenômica construída com DNA extraído de um consórcio microbiano especializado na degradação de bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor e deslignificado foi empregada nos experimentos de triagem funcional de alto desempenho. Como resultado, foram identificados três clones positivos com atividade celulolítica e dois clones com atividade xilanolítica. A análise dos insertos de cada um dos clones resultou na localização de ORFs cujas sequências de aminoácidos apresentaram identidade com domínios conservados de glicosil hidrolases da família 5 (celulases E-1 e E-2), família 6 (celulase E-3), família 10 (xilanase X-1) e família 16 (glicosil hidrolase X-2). A celulase E-1 apresentou em sua estrutura além do domínio catalítico, E-1 Cat, um domínio de ligação a carboidratos, denominado E-1 CBM, que não apresentou identidade de sequência com domínios conservados conhecidos. A análise funcional do E-1 CBM revelou tratar-se de um CBM específico para cadeias de glucano com grau de polimerização mínimo de cinco unidades de glicose. Ensaios de atividade enzimática em diferentes substratos mostraram que E-1 Cat atuou especificamente na hidrólise das ligações glicosídicas do tipo ß(1,4) entre resíduos de glicose. Os maiores valores de atividade enzimática foram obtidos em pH 7,0 e temperatura de 50ºC. Os parâmetros cinéticos calculados em CMC foram Km igual a 6,05 ± 0,37 mg/mL, Vmax de 42,51 ± 1,2 ?mol/min/mg e eficiência catalítica kcat/Km de 4,06 mL/mg/s. A enzima apresentou termoestabilidade a 40ºC por cinco horas. A atividade enzimática de E-1 Cat em celulose cristalina e bagaço de cana-de-açúcar explodido a vapor resultou na liberação de açúcares solúveis, evidenciando sua potencial aplicação em processos de conversão da biomassa vegetal. Ensaios de atividade em diferentes substratos mostraram que X-1 apresentou maior atividade enzimática em xilana não ramificada, nas condições de pH e temperatura de 6,0 e 45ºC, respectivamente. Os parâmetros cinéticos calculados utilizando como substrato xilana de madeira de faia foram Km de 2,18 ± 0,13 mg/mL, Vmax de 1.435 ± 30,4 ?mol/min/mg e kcat/Km de 496,32 mL/mg/s. Em relação à termoestabilidade, a enzima se manteve estável a 40ºC e 50ºC por seis horas. A hidrólise de substratos complexos com X-1 resultou na liberação de xilooligossacarídeos, xilobiose e xilose, que são compostos que apresentam potencial aplicação nas indústrias alimentícias e de biocombustíveis. Os resultados obtidos neste estudo validaram a abordagem metagenômica desenvolvida para a descoberta de novos genes codificantes para glicosil hidrolases. Além disso, a estratégia descrita nesta tese pode ser estendida para a descoberta de uma miríade de bioprodutos de interesse biotecnológico Due to the necessity of development of renewable sources of energy, it is of great interest the discovery of novel enzymes involved in plant cell wall deconstruction for biofuels production. Metagenomics is a powerful tool for the discovery of novel genes in microbial communities that are not liable to cultivation by traditional techniques. In this context, the aim of this thesis was the development of metagenomic strategies for prospection of novel enzymes involved in plant biomass degradation in sugarcane field soil metagenome and functional characterization of the identified enzymes. The metagenomic library constructed with DNA extracted from a microbial consortium specialized in degradation of steam exploded delignified sugarcane bagasse was used in the experiments of high-performance functional screening. As a result, we identified three positive clones with cellulolytic activity and two clones with xylanolytic activity. The analysis of the inserts from each clone resulted in the location of ORFs whose amino acid sequences showed identity to conserved domains of glycoside hydrolase family 5 (cellulases E-1 and E-2), family 6 (cellulase E-3), family 10 (xylanase X-1) and family 16 (glycoside hydrolase X-2). Cellulase E-1 exhibited in addition to the catalytic domain, E-1 Cat, a carbohydrate binding module, called E-1 CBM, which showed no sequence identity with known conserved domains. Functional analysis of E-1 CBM showed that it is a CBM specific for glucan chains with a degree of polymerization of at least five units of glucose. Assays with a set of different substrates revealed that E-1 Cat hydrolyzed specifically ß(1,4) glycoside bonds between glucose residues. The highest value of enzymatic activity was obtained at pH 7.0 and temperature of 50°C. The kinetic parameters Km, Vmax and catalytic efficiency kcat/Km calculated using CMC were 6.05 ± 0.37 mg/mL, 42.51 ± 1.2 ?mol/min/mg and 4.06 mL/mg/s, respectively. The enzyme showed thermal stability at 40°C for five hours. The enzymatic activity of E-1 Cat in crystalline cellulose and steam exploded sugarcane bagasse resulted in the release of soluble sugars, demonstrating its potential application in processes of biomass conversion. The xylanase X-1 showed higher enzyme activity in debranched xylan, in reactions conducted in pH 6.0 and temperature of 45°C. The kinetic parameters Km, Vmax and catalytic efficiency kcat/Km calculated using beechwood xylan were 2.18 ± 0.13 mg/mL, 1,435 ± 30.4 ?mol/min/mg and 496.32 mL/mg/s, respectively. In relation to thermal stability, the enzyme was stable at 40°C and 50°C for six hours. The hydrolysis of complex substrates resulted in the release of xylo-oligosaccharides, xylobiose and xylose, which are compounds that have potential application in food and biofuels industries. The results of this study validated the metagenomic approach developed for the discovery of novel genes coding for glycoside hydrolases. Moreover, the strategy described in this work can be extended to the discovery of a myriad of byproducts of biotechnological interest Doutorado Bioquimica Doutora em Biologia Funcional e Molecular |
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