Produção e purificação de penicilina G acilase.

Autor: Pinotti, Laura Marina
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2005
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFSCARUniversidade Federal de São CarlosUFSCAR.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
Popis: Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DoutLMP.pdf: 2279571 bytes, checksum: 007958befffa499c1eb6c72cc2b515c8 (MD5) Previous issue date: 2003-06-26
Universidade Federal de Minas Gerais
The main objective of the present work was the study of PGA of B. megaterium production process and purification. The following production aspects were investigated in flasks and/or fermenter: the study of the purity of the culture, the standardization and the conservation of the inoculum, the optimization of the total time of cultivation (germination/propagation and production), the volume of the inoculum, the nutritional requirements of the B. megaterium for the production of the enzyme, the pH, the concentration of dissolved oxygen and the nutrients feeding mode. It was concluded that the conservation of the microorganism in cryovials, in presence the glycerol, showed to be efficient. The germination took 11 hours and the production, 24 hours, which is enough time for the process to reach the maximum production of the enzyme. With respect to the inoculum volume, 3 mL of inoculum/75 mL of medium (108 espores/mL of inoculum), in flasks of 500 mL, were found to be the appropriate conditions for its production. Different sources of carbon and nitrogen were studied and it was verified that glucose, glycerol and concentrations of amino acids above 10.0 g/L repress the synthesis of the enzyme. The largest production of PGA for B. megaterium occurs when the microorganism grows consuming free amino acids, phenylacetic acid (inductor), in the presence of some factor present in the cheese whey. The different components of the cheese whey were investigated and it was verified that none of the macronutrients is responsible for the significant effect of the whey on the production of the enzyme. This work allowed an increase on the enzymatic activities from 56 UI/L and 8,6 UI/g cell, obtained in the first experimental run with the standard inoculum, to 220 UI/L and 65 UI/g cell with the following conditions: 10 g/L of amino acids, 19,6 g/L of cheese whey, 0,4 g/L of salts, 2,7 g/L phenylacetic acid (AFA), initial pH 8,0, absence of pH control, addition of AFA in the beginning of the cultivation and control of dissolved oxygen around 20% of the saturation. During a research stage in Portugal, an investigation on the PGA production by Escherichia coli was also carried out in order to study the technique of adsorption in expanded bed and comparison of the conditions of production of the enzyme for E. coli with those used for B. megaterium. The maximum PGA production using E. coli was 400 UI/L. The same operational conditions used for E. coli were tested for B. megaterium and they didn't result in the enzyme production. In the study of the concentration and purification of the enzyme produced by B. megaterium, the ethanol precipitation technique was optimized. In addition, the ultrafiltration and adsorption in expanded bed (EBA) techniques were also studied. Using ultrafiltration, at 4ºC, enzyme concentrations up to 1541UI/L was reached, without thermal inactivation. The optimization of the previously study conditions results in: flow rate of 0.03 mL/s for the initial 22 mL of ethanol and 0.25 mL/s for the 98 mL of remaining ethanol, with adjustment of the pH of the broth for 6, without the previous dialysis. In the application of the adsorption in expanded bed the dynamic binding capacity found for PGA in clarified broth was about 5 UI / mL of adsorbent, with recovery of 30% of the initial enzyme. A similar value for the dynamic binding capacity was found for PGA of E. coli.
Este trabalho teve como objetivo principal estudar o processo de produção e purificação de PGA de B. megaterium. A produção foi estudada em frascos agitados e/ou fermentador, abordando-se os seguintes aspectos: estudo da pureza da cultura, padronização e conservação do inóculo, otimização do tempo total de cultivo (germinação/propagação e produção), volume do inóculo, requerimentos nutricionais do B. megaterium para a produção da enzima, pH, concentração de oxigênio dissolvido e modo de alimentação. A partir desses ensaios concluiu-se que a conservação do microrganismo em criotubos, na presença de glicerol, mostrou ser eficiente. Tempo de germinação de 11 horas e 24 horas na etapa de produção são os suficientes para atingir máxima produção da enzima. Quanto ao volume de inóculo, 3 mL de inóculo/75 mL de meio (108 esporos/mL de inóculo), em frascos de 500 mL, foram as condições ótimas encontradas para produção deste. Diferentes fontes de carbono e nitrogênio foram estudadas e verificou-se que glicose, glicerol e concentrações de aminoácidos acima de 10,0 g/L reprimem a síntese da enzima e que a maior produção de PGA por B. megaterium ocorre quando o microrganismo cresce consumindo aminoácidos livres, ácido fenil acético (indutor), na presença de algum fator presente no soro de queijo. Os diferentes componentes do soro de queijo foram investigados e verificou-se que nenhum dos macronutrientes é o responsável pelo significativo efeito do soro na produção da enzima. Este trabalho permitiu o aumento das atividades enzimáticas de 56 UI/L e 8,6 UI/g célula, obtidas no primeiro ensaio realizado com o inóculo padronizado, para 220 UI/L e 65 UI/g célula com as seguintes condições: 10 g/L de aminoácidos, 19,6 g/L de soro de queijo, 0,4 g/L de sais, 2,7 g/L de ácido fenil acético (AFA), pH inicial 8,0, ausência de controle de pH, adição de AFA no início do cultivo e controle de oxigênio dissolvido próximo de 20% da saturação. Foi também realizado, durante estágio em Portugal, estudo de produção de PGA por Escherichia coli, visando estudo posterior da técnica de adsorção em leito expandido e comparação das condições de produção da enzima por E. coli com as utilizadas para B. megaterium. A máxima produção de enzima obtida foi de 400 UI/L. As mesmas condições operacionais utilizadas para E. coli foram testadas para B. megaterium e não resultaram na produção de enzima. No estudo da concentração e purificação da enzima produzida por B. megaterium foi otimizada a técnica de precipitação com etanol, cujo estudo se iniciou em trabalho prévio, e estudadas as técnicas de ultrafiltração e adsorção em leito expandido (A.L.E). A ultrafiltração conseguiu concentrar a enzima até atividade final 1541UI/L. A temperatura mostrou ser uma variável importante, conseguindo-se evitar inativação térmica da enzima concentrada realizando-se a técnica a 4ºC. No processo de precipitação com etanol, os melhores resultados foram obtidos com vazão de 0,03 mL/s para os 22 mL iniciais de etanol e de 0,25 mL/s para os 98 mL de etanol restantes, com ajuste do pH do caldo para 6, sem a realização prévia de diálise. Na aplicação da adsorção em leito expandido a capacidade de ligação dinâmica encontrada para a PGA em caldo clarificado foi próxima de 5 UI/ mL de gel, com recuperação global de 30 % da enzima inicial. Valor similar para a capacidade de ligação dinâmica foi encontrado para PGA de E. coli.
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