Papel da prote?na de reparo XPC na regula??o das prote?nas de reparo APE1, OGG1 e PARP-1 em c?lulas humanas e de camundongos

Autor: Melo, Julliane Tamara Ara?jo de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2014
Předmět:
Zdroj: Repositório Institucional da UFRNUniversidade Federal do Rio Grande do NorteUFRN.
Druh dokumentu: Doctoral Thesis
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Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico
studies using UV as a source of DNA damage. However, even though unrepaired UV-induced DNA damages are related to mutagenesis, cell death and tumorigenesis, they do not explain phenotypes such as neurodegeneration and internal tumors observed in patients with syndromes like Xeroderma Pigmentosum (XP) and Cockayne Syndrome (CS) that are associated with NER deficiency. Recent evidences point to a role of NER in the repair of 8-oxodG, a typical substrate of Base Excision Repair (BER). Since deficiencies in BER result in genomic instability, neurodegenerative diseases and cancer, it was investigated in this research the impact of XPC deficiency on BER functions in human cells. It was analyzed both the expression and the cellular localization of APE1, OGG1 e PARP-1, the mainly BER enzymes, in different NER-deficient human fibroblasts. The endogenous levels of these enzymes are reduced in XPC deficient cells. Surprisingly, XP-C fibroblasts were more resistant to oxidative agents than the other NER deficient fibroblasts, despite presenting the highest of 8-oxodG. Furthermore, subtle changes in the nuclear and mitochondrial localization of APE1 were detected in XP-C fibroblasts. To confirm the impact of XPC deficiency in the regulation of APE1 and OGG1 expression and activity, we constructed a XPC-complemented cell line. Although the XPC complementation was only partial, we found that XPC-complemented cells presented increased levels of OGG1 than XPC-deficient cells. The extracts from XPC-complemented cells also presented an elevated OGG1 enzimatic activity. However, it was not observed changes in APE1 expression and activity in the XPCcomplemented cells. In addition, we found that full-length APE1 (37 kDa) and OGG1- ? are in the mitochondria of XPC-deficient fibroblasts and XPC-complemented fibroblasts before and after induction of oxidative stress. On the other hand, the expression of APE1 and PARP-1 are not altered in brain and liver of XPC knockout mice. However, XPC deficiency changed the APE1 localization in hypoccampus and hypothalamus. We also observed a physical interaction between XPC and APE1 proteins in human cells. In conclusion, the data suggest that XPC protein has a role in the regulation of OGG1 expression and activity in human cells and is involved mainly in the regulation of APE1 localization in mice. Aditionally, the response of NER deficient cells under oxidative stress may not be only associated to the NER deficiency per se, but it may include the new functions of NER enzymes in regulation of expression and cell localization of BER proteins
A maior parte do nosso conhecimento sobre a via de Reparo de Excis?o Nucleot?deos (NER) vem de estudos usando a luz ultravioleta (UV) como fonte de danos no DNA. Contudo, embora os danos no DNA causados pela luz UV sejam relacionados ? ocorr?ncia de mutag?nese, morte celular e tumorig?nese, eles n?o justificam fen?tipos como neurodegenera??o e tumorig?nese observados em pacientes com s?ndromes como Xeroderma Pigmentosum (XP) e S?ndrome de Cockayne (CS), as quais s?o associadas ? defici?ncia na via NER. Adicionalmente, evid?ncias mais recentes indicam o envolvimento da via NER no reparo de 8-oxodG, um substrato t?pico da via de Reparo por Excis?o de Bases (BER). Uma vez que a defici?ncia na via BER resulta em instabilidade gen?mica, doen?as neurodegenerativas e c?ncer, foi investigado neste trabalho o impacto da defici?ncia em XPC nas fun??es da via BER em c?lulas humanas. Foram realizadas an?lises da express?o e da localiza??o celular de APE1, OGG1 e PARP-1, principais enzimas da via BER, em fibroblastos humanos deficientes na via NER. Os resultados demonstraram que os n?veis end?genos de APE1, PARP-1 e OGG1 s?o reduzidos nos fibroblastos deficientes em XPC, os quais foram mais resistentes a diferentes tipos de agentes oxidantes e apresentaram n?veis elevados de 8-oxodG quando comparados aos demais fibroblastos deficientes na via NER. Adicionalmente, altera??es sutis na localiza??o nuclear e mitocondrial de APE1 foram observadas nos fibroblastos deficientes em XPC. Para confirmar o impacto da defici?ncia de XPC na regula??o da express?o e atividade de APE1 e OGG1, foi constru?da uma linhagem complementada com XPC. Embora a complementa??o tenha sido parcial, foi poss?vel observar que os fibroblastos parcialmente complementados com XPC apresentaram n?veis maiores de express?o de OGG1 quando comparados aos fibroblastos deficientes em XPC. Os extratos dos fibroblastos parcialmente complementados com XPC tamb?m apresentaram uma elevada atividade enzim?tica de OGG1. Contudo, n?o foram observadas mudan?as na express?o e atividade de APE1 nos fibroblastos parcialmente complementados com XPC. Adicionalmente, foi poss?vel verificar a presen?a da forma completa de APE1 (37 kDa) e de OGG1-? na mitoc?ndria dos fibroblastos deficientes em XPC e parcialmente complementados com XPC. Por outro lado, observou-se que a express?o de APE1 e PARP-1 n?o ? alterada no c?rebro e f?gado de camundongos knockouts para XPC. Contudo, a defici?ncia em XPC resultou em mudan?as na localiza??o celular de APE1 no hipocampo e hipot?lamo. Ainda, foi observada a ocorr?ncia de uma intera??o f?sica entre as prote?nas XPC e APE1 em c?lulas humanas. Em conclus?o, os dados sugerem que a prote?na XPC possui um papel na regula??o da express?o e da atividade de OGG1 em c?lulas humanas e est? envolvida na regula??o da localiza??o celular de APE1 principalmente em camundongos. Adicionalmente, as respostas celulares dos fibroblastos deficientes na via NER ao estresse oxidativo podem n?o estar associadas ? defici?ncia na via NER per se, mas podem incluir novas fun??es das enzimas da via NER na regula??o da express?o e localiza??o celular das prote?nas da via BER
2020-01-01
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