Avaliação da citotoxicidade e seletividade do extrato, frações e alcaloide de Geissospermum sericeum (Apocynaceae) em linhagens celulares ACP02, HepG2 e VERO

Autor: BASTOS, Mírian Letícia Carmo
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2017
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Zdroj: Repositório Institucional da UFPAUniversidade Federal do ParáUFPA.
Druh dokumentu: masterThesis
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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
O presente estudo avaliou a atividade antitumoral de G. sericeum em linhagens de células tumorais de adenocarcinoma gástrico primário paraense (ACP02), a seletividade e o mecanismo de morte celular. O pó obtido das cascas de G. sericeum foi submetido a maceração exaustiva com etanol e a solução concentrada em evaporador rotativo até resíduo. Para o fracionamento do extrato de G. sericeum utilizou-se extração sob refluxo e partição ácido: base. A fração alcaloídica (FAGS), obtida da partição ácido:base, foi submetida ao fracionamento em coluna cromatográfica aberta, utilizando como fase estacionária Sephadex LH-20 e fase móvel o metanol, dando origem a subfração F6FAGS. Esta subfração foi submetida ao fracionamento através da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Semipreparativa, isolando o alcaloide indólico F3F6FAGs. A atividade antitumoral e a citotoxicidade do extrato etanólico, frações, subfrações e F3F6FAGS foram avaliadas através do ensaio de viabilidade celular com o MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio]) em células ACP02, células de hepatoma humano (HepG2) e em linhagem de células normais de rim de macaco verde africano (VERO). Foram consideradas ativas como antitumoral as amostras com concentração inibitória (CI50) menor que 100 μg/mL em células ACP02. Foram consideradas citotóxicas as amostras com concentração citotóxica (CC50) menor que 100 μg/mL em células HepG2 e VERO. O índice de seletividade (IS) foi obtido a partir da razão entre os valores da CC50 e CI50 e foram consideradas seletivas as amostras com IS maior que 2, demonstrando que essa atividade é duas vezes mais seletiva para células tumorais. As amostras mais seletivas foram submetidas à quantificação de morte celular com corantes fluorescentes Hoechst 33342 (HO), Iodeto de Propídeo (PI) e Fluoresceína Diacetato (DAF) em 24 e 72 horas de exposição. Todas as amostras foram ativas ou moderadamente ativas para atividade antitumoral e apresentaram moderada atividade citotóxica ou não foram citotóxicas. A FAGS e F3F6FAGS tiveram menor CI50 (FAGS = 18,29 μg/mL e F3F6FAGS = 12,06 μg/mL), maior CC50 (FAGS-CC50 = 173,3 μg/mL para VERO e 299,45 μg/mL para HepG2 e F3F6FAGS CC50 476 μg/mL para células renais e CC50 503,5 μg/mL para células hepáticas) e foram mais seletivas (F3F6FAGS- IS = 39,4 para VERO e IS = 41,74 para HepG2 e FAGS- IS = 9,5 para VERO e IS = 16,37 para HepG2). A FAGS apresentou maior efeito apoptótico e necrótico em 24 e 48h, com o aumento da taxa de necrose nas maiores concentrações e no maior do tempo de exposição. Para o alcalóide, a apoptose e necrose mostraram-se concentração e tempo- dependentes, com menor índice de necrose. Esses resultados sugerem seletividade de F3F6FAGS para câncer gástrico. Porém, a maior citotoxicidade e a menor seletividade da FAGS, provavelmente, estão relacionadas ao sinergismo de seus alcaloides para apoptose e necrose.
This study evaluated the antitumor activity of G. sericeum in primary gastric adenocarcinoma (ACP02), the selectivity and the mechanism of cell death. The G. sericeum bark powder was submitted to the exhaustive maceration with ethanol, which he resultant solution was concentrated on rotaevaporator until residue. For the fractionation of G. sericeum extract was used the fractionation under reflux and acid-basic partition. The alkaloid fraction (FAGS) obtained from the acid-basic partition was submitted to the open chromatography column (OCC), using Sephadex LH – 20 as stationary fase and the methanol as mobile fase, resulting in the subfracion F6FAGS. This subfracion was submitted to semi-preparative high performance liquid chromatography (HPLC) and the indole alkaloid (F3F6FAGS) was isolated. The cytotoxicity and antitumor activity of the ethanol extract, its fractions and F3F6FAGS were assessed through cell viability assay with MTT ([3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]) in tumor-cell lines: ACP02, hepatocellular carcinoma (HepG2) and normal VERO cells (African green monkey). The samples with inhibitory concentration (IC50) below 100 μg/mL were considered active for antitumor activity in ACP02. The samples with IC50 ≤ 100 μg/mL were considered cytotoxic for cell lines HepG2 and VERO. The selectivity index (SI) was obtained from the ratio between the CC50 and IC50 values and the samples were considered selective with SI higher than two, indicating that this activity is twice selective for tumor cells. The most selective samples were submitted to quantification of cell death with fluorescent dyes Hoechst 33342 (HO), Propionium Iodide (PI) and Fluorescein Diacetate (FDA) during 24 and 72 hours of exposure. All samples were active or moderately active for antitumor activity and exhibited moderate cytotoxic activity or were not cytotoxic. The FAGS and indole alkaloid had lower IC50 (FAGS = 18, 29 μg/mL e F3F6FAGS = 12, 06 μg/mL) bigger CC50 (FAGS-CC50 = 173, 3 μg/mL for VERO and 299,45 μg/mL for HepG2 and F3F6FAGS CC50 476 μg/mL for renal cells and CC50 503,5 μg/mL for hepatic cells) and were more selective (F3F6FAGS- SI = 39,4 for VERO and SI = 41,74 for HepG2 and FAGS- SI = 9,5 for VERO and SI = 16,37 for HepG2). The FAGS had greater apoptosis and necrosis in 24h and 48h with increased necrosis in the higher concentrations and with the increase of the exposure time. For alkaloid, apoptosis and necrosis were shown concentration and time-dependent, with a lower necrosis rate. These results suggest some selectivity of the F3F6FAGS alkaloid for gastric cancer. However, the bigger cytotoxicity and the lower selectivity of FAGS are probably related to the synergism of its alkaloids for apoptosis and necrosis.
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