Influência dos Carboidratos e da Expressão de Genes Relacionados à Parede Celular na Floculação de Saccharomyces Cerevisiae

Autor: SANTOS, R. V.
Rok vydání: 2016
Zdroj: Repositório Institucional da UFESUniversidade Federal do Espírito SantoUFES.
Druh dokumentu: masterThesis
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Desde os primórdios da civilização, o Homem utiliza as fermentações microbianas para a produção de diversos bens de consumo. A levedura Saccharomyces cerevisiae é, sem dúvida, o maior expoente dos processos fermentativos conhecidos, responsável pela fabricação do pão, da cerveja, do vinho cachaça e do bioetanol. S. cerevisiae foi o primeiro organismo eucarionte a ter seu genoma sequenciado e vem sendo utilizada há várias décadas como um modelo eucarionte para estudos celulares e moleculares. A parede celular de levedura é uma robusta estrutura composta por uma camada estrutural interna de glucanos e quitina, e uma camada externa de manoproteínas covalentemente ligadas à camada estrutural, que determinam a maior parte das propriedades de superfície da célula.A floculação de levedura pode ser definida como um processo não sexual, reversível e cálcio-dependente de agregação de células em massas multicelulares, chamadas flocos, com a subsequente sedimentação a partir do meio em que elas estão suspensas. É um processo muito complexo e depende de numerosos fatores, tais como as características do meio (pH e a presença de cátions), de oxigênio (condições de fermentação, os açúcares, a temperatura de crescimento e a concentração de etanol) e a expressão dos genes da família FLO. O processo envolve a interação de proteínas de células especializadas denominadas parede lectinas, presente apenas em células floculantes, e carboidratos (receptores) na parede celular das células vizinhas. Propriedades de floculação especificamente ajustadas poderia levar a uma melhoria no processamento de produtos biotecnológicos de fermentação, tais como alimentos, bebidas e biocombustíveis. Dados anteriores do grupo sobre a identificação do perfil de floculação entre cepas selvagens de levedura isoladas dediferentes alambiques mostraram duas cepas com um perfil característico de sedimentação (BT0510 BT0605), enquanto outras duas (BT0505 e BT0601)sem capacidade de floculação.Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a relação entre o conteúdo de carboidratos (glicose e manose) da parede celular e de genes floculantes e relacionados à parede com o processo da floculação, a fim de melhor entender os fatores que causam a diferença no comportamento floculante. As células de levedura foram cultivadas em meio YEPD, incubadas a 28 º C e 150 rpm de agitação. A parede celular foi extraída por combinação de sonicação, agitação vigorosa com pérolas de vidro e de ebulição em solução detergente. Após lavagem extensiva com águaultra pura, o pellet contendo a parede celular foi incubado a 80 º C para secagem completa e determinação do peso seco. Em seguida, as amostras foram submetidas a uma hidrólise com ácido sulfúrico, precipitação de íons sulfato por adição de Ba(OH)2, e concentração a vácuo. Os monossacarídeos liberados foram analisados por HPLC numa coluna de REZEX-RHM, eluição isocrática com água ultra pura, detector de refração diferencial a 60 º C. Por PCR em tempo real foram comparados os níveis de expressão dos genes FLO e de genes relacionados à parede celular entre uma cepa floculante e outra não-floculante. Não foi encontrada diferença significativa entre o teor de glicose e manose nas cepas floculantes e não floculantes, o que sugere que o perfil de floculação não está diretamente relacionado com a concentração de carboidratos de parede celular. A análise da expressão gênica relativa mostrou um aumento significativo dos genes da família FLO (FLO1, FLO8 e FLO10) na cepa floculante, confirmando as expectativas. Um grande aumento, de 27 vezes, foi observado no gene CWP1, corroborando com estudos que sugerem uma grande importância deste gene para a integridade da parede celular e para o processo de floculação. Também houve aumento de outros genes relacionados à parede celular. Estudos de proteômica da parede celular, além de análise em espectrometria de massas poderiam ajudar a elucidar os resultados encontrados, e contribuir para o melhor entendimento da floculação nos processos fermentativos.
Databáze: Networked Digital Library of Theses & Dissertations
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