Fotobiomodulação do burst oxidativo e da atividade microbicida de monócitos humanos in vitro e análise da expressão gênica em macrófagos derivados destas células

Autor: CASTRO, Mayara Santos de
Jazyk: portugalština
Rok vydání: 2018
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFALUniversidade Federal de AlfenasUNIFAL.
Druh dokumentu: masterThesis
Popis: A fotobiomodulação (PBM) utiliza a luz nas porções do espectro visível e infravermelho para estimular a produção de trifosfato de adenosina (ATP), síntese de ácidos nucleicos, geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e proliferação celular, promovendo resultados teraupêuticos benéficos, como a aceleração do reparo tecidual, analgesia e ativação de células do sistema imune. Deste modo, a presente pesquisa visou elucidar os efeitos da PBM sobre monócitos humanos in vitro, a fim de possivelmente estimular o burst oxidativo e, consequentemente, potencializar a defesa imune celular contra micro-organismos, além de analisar a expressão gênica em nível de RNA mensageiro (mRNA) de CD68, CD80, CD163, CD204, IL-6, TNF-α, IL-10 e SOD1 em macrófagos derivados destas células. Neste contexto, culturas primárias de monócitos humanos foram irradiadas com o laser de diodo InGaAlP (660nm)/ GaAlAs (780nm) - Twin Flex® (MMO, São Carlos, SP, Brasil), operando com potência de 40mW, área de feixe de 0,04cm2, densidade de potência de 1W/cm2 e doses independentes de 200J/cm2, 400J/cm2 e 600J/cm2. Após isto, as células foram submetidas ao ensaio de quimioluminescência para avaliação do burst oxidativo e quantificação da produção de ROS intracelulares e extracelulares. Ensaio da atividade microbicida foi realizado contra o fungo Candida albicans. Como controles positivo e negativo, utilizou-se o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e o diphenyleneiodonium (DPI), respectivamente. A viabilidade celular foi verificada por meio do reagente azul de Trypan. Adicionalmente, os monócitos humanos irradiados foram cultivados por 72 horas, a fim de observar a diferenciação destas células em macrófagos mediante estímulos relacionados a macrófagos ativados pela via clássica (M1) (LPS e Candida albicans) e a macrófagos ativados pela via alternativa (M2) (M-CSF). O RNA total foi extraído de cada grupo experimental e submetido à transcrição reversa e PCR em tempo real. GAPDH foi utilizado como controle endógeno e a expressão relativa de cada gene foi calculada utilizando o método 2-ΔCt. A produção de nitrito (NO2) também foi mensurada através da reação de Griess. Os resultados obtidos foram analisados por ANOVA e teste de Tukey ao nível de significância de 5%. Para dados com variâncias desiguais, utilizou-se o Kruskal-Wallis e pós-teste de Newman-Keuls. Desta forma, os monócitos irradiados apresentaram um aumento significativo na produção de ROS intracelulares e extracelulares comparativamente ao grupo controle (P < 0,001), sendo o comprimento de onda de 660nm e a dose de 400J/cm2, os parâmetros que mais se destacaram (P < 0,001). Como consequência deste perfil funcional elevado dos monócitos irradiados, a capacidade fungicida dos mesmos contra Candida albicans mostrou-se bastante aumentada (P < 0,001). Além disso, observou-se que a PBM (660nm; 400J/cm2) não causou danos à viabilidade celular dos monócitos nos dias subsequentes à irradiação laser. A análise da expressão gênica revelou que a PBM (660nm; 400J/cm2) aumentou significativamente a expressão da citocina pró-inflamatória TNF-α pelos monócitos irradiados (P = 0,0302), aproximando-os de uma resposta imune Th1. Complementarmente, um aumento significativo na produção de NO2 pelos monócitos irradiados também foi observado (P < 0,05). Portanto, a PBM, como empregada neste estudo, foi capaz de aumentar a geração de ROS e NO2, intensificar a atividade microbicida contra Candida albicans e aumentar a expressão de TNF-α, sugerindo uma modulação da PBM na indução de agentes pró-inflamatórios relacionados ao perfil funcional de M1. Vislumbramos em um futuro próximo, a reprodução desses resultados em monócitos humanos in vivo, colaborando no tratamento de candidoses orais, por exemplo.
Photobiomodulation (PBM) comprises the use of light within the visible and infrared spectrum to stimulate the production of adenosine triphosphate (ATP), nucleic acid synthesis, generation of reactive oxygen species (ROS) and cell proliferation, thus promoting beneficial therapeutical results, such as the acceleration of tissue repair, analgesia and activation of cells of the immune system. In that way, the present research aimed to elucidate the effects of PBM on human monocytes in vitro by possibly stimulating the oxidative burst of these cells and, consequently, enhancing the cellular immune defense against microorganisms, in addition to analyzing the gene expression at the messenger RNA (mRNA) level of CD68, CD80, CD163, CD204, IL-6, TNF-α, IL-10 and SOD1 in macrophages derived from these cells. Thus, primary cultures of human monocytes were irradiated with an InGaAlP (660nm)/ GaAlAs (780nm) - Twin Flex® diode laser (MMO, São Carlos, SP, Brazil), operating with power of 40mW, beam area of 0.04cm2, power density of 1W/cm2 and independent doses of 200J/cm2, 400J/cm2 e 600J/cm2. Cells were then submitted to the chemiluminescence assay for oxidative burst evaluation and quantification of intracellular and extracellular ROS production. A microbicidal activity assay was performed against the fungus Candida albicans. As positive and negative controls, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and diphenyleneiodonium (DPI) were used, respectively. Cell viability was verified by Trypan blue reagent. Besides, irradiated human monocytes were cultured for 72 hours in order to observe the differentiation of these cells into macrophages by stimuli related to macrophages activated by the classical pathway (M1) (LPS and Candida albicans) and macrophages activated by the alternative pathway (M2) (M-CSF). Total RNA was extracted from each experimental group and submitted to reverse transcription and real-time PCR. GAPDH was used as endogenous control and the relative expression of each gene was calculated using the 2-ΔCt method. The production of nitrite (NO2) was also measured by the Griess reaction. The results obtained were analyzed by ANOVA and Tukey's test at a significance level of 5%. For data with unequal variances, Kruskal-Wallis and Newman-Keuls post-test were used. In that way, irradiated monocytes presented a significant increase in intracellular and extracellular ROS production compared to the control group (P < 0.001). The wavelength of 660nm and the dose of 400J/cm2 were the most relevant parameters (P < 0.001). As a consequence of this high functional profile of the irradiated monocytes, the fungicidal capacity of the monocytes against Candida albicans was shown to be greatly increased (P < 0.001). In addition, it was observed that PBM (660nm; 400J/cm2) did not cause damage to the cell viability of monocytes in the days following laser irradiation. Analysis of the gene expression revealed that PBM (660nm; 400J/cm2) significantly increased the expression of the proinflammatory cytokine TNF-α by the irradiated monocytes (P = 0.0302), bringing them closer to a Th1 immune response. Additionally, a significant increase in NO2 production by irradiated monocytes was also observed (P < 0.05). Therefore, PBM, as employed in this study, was able to increase ROS and NO2 generation, enhance microbicidal activity against Candida albicans and increase TNF-α expression, suggesting a modulation of PBM in the induction of related pro-inflammatory agents to the functional profile of M1. We envisage in a near future, the reproduction of these results in human monocytes in vivo, which would collaborate to the treatment of oral candidoses, for example.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
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