Orientierungsstudie zum Einsatz ausgewählter Peptide von Mücken der Gattung Culicoides bei Pferden mit Culicoides-Hypersensitivität und in der Serologie

Autor: Krosch, Kathrina
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2023
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Druh dokumentu: Text<br />Doctoral Thesis
Popis: Die Therapiemöglichkeiten für Pferde, die an Culicoides-Hypersensitivität (Sommerekzem) leiden, sind heute noch oft unbefriedigend. Sie reduzieren sich größtenteils auf symptomatische Behand-lungen und auf die Vermeidung der allergieauslösenden Allergene. Es existieren Studien, bei denen rekombinante Proteine in ihrer Wirksamkeit auf die Culicoides-Hypersensitivität beim Pferd untersucht wurden. Für die spezifische Immuntherapie gibt es in der Veterinärmedizin bislang keine oralen Präparate für eine mögliche sublinguale Therapie. Am Beispiel der Culicoides-Hypersensitivität soll letztlich ein Verfahren für die spezifische Immuntherapie entwickelt werden, bei dem die Peptide sowohl zur Diagnostik als auch Therapie allergischer Erkrankungen in der Veterinärmedizin genutzt werden können. In der vorliegenden Studie wurden erste Schritte in diese Richtung unternommen. Dafür wurden eine intrakutan zu applizierende Darreichungsform und eine für das Pferd neuartige, sublingual zu applizierende Arzneiform eingesetzt. Ausgewählte, synthetisch hergestellte Peptide von Mücken der Gattung Culicoides wurden bezüglich ihres Potentials für die spezifische Immuntherapie hinsichtlich der Sicherheit bei ihrer Anwendung im Pferd und Nutzung in der serologischen Diagnostik untersucht. Sieben ausgewählte Peptide, bestehend aus 30-35 Aminosäuren, wurden für in-vitro und in-vivo-Untersuchungen an gesunden (n=6) und an Sommerekzem erkrankten (n=12) Pferden eingesetzt. Nach einer Testphase auf die Verträglichkeit an klinisch gesunden Pferden, wurden die an Culicoides-Hypersensitivität erkrankten Tiere randomisiert in zwei Gruppen (intradermale und sublinguale Arzneiform) eingeteilt. Sie bekamen im Sonner, bei möglicher natürlicher Culicoides-Exposition die jeweilige Arzneiform über 21 Wochen hinweg verabreicht. Während dieser Zeit fanden in regelmäßigen Abständen Kontrollen des Gesundheitszustandes der Tiere statt, bei denen insbesondere klinische Symptome, Blutbilder und die Bildung spezifischer Antikörper erfasst wurden. Das Hautbild der Tiere wurde in Woche 1, 13 und 25 mithilfe eines Sommerekzem-Scores beurteilt. Die zwölf häufigsten vom Ekzem betroffenen Stellen am Pferde-körper wurden hierbei unabhängig voneinander bewertet. Die Besitzer der Tiere wurden mithilfe eines Fragebogens nach ihrer Meinung zur Entwicklung bzw. Ausprägung der klinischen Symptome und dem Befinden ihres Pferdes befragt. Zur Detektion spezifischer Antikörper im Serum der Tiere, unter Verwendung rekombinanter Pepti-de als Antigen, konnten für IgE und die IgG-Isotypen IgG1, IgG3/5 und IgG4/7 direkte bzw. indirekte ELISA etabliert werden. Des Weiteren wurde ein kommerzielles ELISA-Kit verwendet, um den Verlauf der IgE-Gesamtkonzentration während der Studienlaufzeit zu untersuchen. Aufgrund der geringen Studienteilnehmerzahl und vieler nicht verwendbarer Daten aus den ELISA Untersuchungen wurde die statistische Auswertung auf deskriptive Analysen beschränkt. Beide Applikationsarten wurden von den Studienteilnehmern gut toleriert und vertragen. Die Verabreichung der Sublingualtablette konnte durch die zuvor geschulten Pferdebesitzer eigenständig durchgeführt werden. Zu Beginn der Studie betrug der Dermatitisgrad 14 Punkte in der intradermalen Gruppe bzw. 13,67 Punkte in der sublingualen Gruppe. Am Ende der Studienlaufzeit lag der durchschnittliche Dermatitisgrad bei 40,33 bzw. 38,50 Punkten. Damit verschlechterte er sich während der Studienlaufzeit. Der Gehalt an gesamtem IgE im Serum der Probanden sank während des Untersuchungszeitraumes über beide Gruppen hinweg von 2,7 U/l auf 2,1 U/l. Bei den Tieren der Intradermalen Applikationsgruppe reduzierte sich das freie IgE dabei um 0,8 U/l und in der Sublingualen Gruppe um 0,3 U/l. Die Peptid-basierten ELISA zur spezifischen Serologie verschiedener Serum-Antikörperklassen waren nicht valide auswertbar. Die Untersuchungen zu peptidspezifischen IgE ergaben individuelle Verlaufsformen. Da keine Kontrollgruppe ohne Peptid-Applikation eingeschlossen wurde und die Studie in der Saison mit unkontrollierter, natürlicher Culicoides-Exposition durchgeführt wurde, ist keine Aussage zur Wirksamkeit der Behandlung auf klinische oder serologische Parameter möglich. Die entwickelte Sublingualtablette war durch ihre Form, Stabilität und Handhabung gut anwendbar und kann als Applikationsmethode in der Veterinärmedizin in Erwägung gezogen werden. Die synthetischen Peptide waren für den Einsatz in-vivo unschädlich und einsetzbar. Es bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten, ihr diagnostisches und therapeutisches Potential zur An-wendung bei Culicoides-Hypersensitivität und gegebenenfalls weiteren allergisch bedingten Erkrankungen des Pferdes weiter zu evaluieren. Aufgrund von limitierenden Faktoren, wie der sehr kleinen Zahl an Studienteilnehmern, dem Fehlen einer Placebogruppe und der Durchführung während der Expositionszeit hat die vorliegende Arbeit insgesamt präliminären Charakter.:Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Allergie 2.1.1 Allergene 2.1.1.1 Charakteristika von Allergenen (Was macht eine Substanz zum Allergen) 2.1.1.2 Kreuzreaktivitäten 2.1.2 Typ-I-Allergie 2.1.2.1 Produktion sensibilisierender Antikörper bei Erstkontakt 2.1.2.2 Ausbildung allergischer Reaktionen bei Folgekontakt 2.1.3 Immunglobulin-System des Pferdes 2.1.4 Potenzielle Bedeutung der IgG-Isotypen bei verschiedenen Erkrankungen 2.2 Das Sommerekzem des Pferdes 2.2.1 Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese 2.2.2 Bedeutende Allergene 2.2.3 Diagnostische Ansätze 2.2.3.1 In-vivo-Test (Intradermal Test) 2.2.3.2 In-vitro-Tests 2.2.3.3 Nachweis von IgE 2.2.3.4 Funktionelle in-vitro-Tests 2.2.4 Therapeutische Ansätze 2.2.4.1 Vermeidung Allergenkontakte, medikamentöse Therapieversuche 2.2.4.2 Allergenspezifische Immuntherapie (ASIT) 2.2.4.3 Desensibilisierung mit nativen Allergenextrakten 2.3 Wechsel von Allergenextrakten auf die molekulare Ebene der Allergene - Bedeutung für Diagnostik und Therapie 2.4 Einsatz synthetischer Peptide in der ASIT 3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte 3.2 Material 3.2.1 Klinikbedarf 3.2.2 Laborbedarf 3.2.3 Reagenzien, Puffer und Lösungen 3.2.4 Allergene (Peptide) - Auswahl und Synthese 3.2.5 Antikörper 3.3 Tiere 3.3.1 Gesunde Kontrollgruppe 3.3.2 An Sommerekzem erkranke Studienteilnehmer 3.4 Methoden 3.4.1 Blutentnahme und weitere Verarbeitung 3.4.2 Herstellung der arzneilichen Formulierungen 3.4.2.1 Arzneiliche Formulierung für die intradermale Applikation 3.4.2.2 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation 3.4.3 Prüfung der Unbedenklichkeit an klinisch gesunden Pferden 3.4.3.1 Durchführung der Unbedenklichkeitsprüfung 3.4.3.2 Kontrollen des Gesundheitsstatus 3.4.4 Verabreichung der hergestellten Applikationslösungen an Patienten 3.4.4.1 In-Vivo-Test (Intradermaltest) 3.4.4.2 Intradermale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen 3.4.4.3 Orale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen 3.4.5 Klinische Veränderungen infolge der SIT 3.4.5.1 Dokumentation und klinische Beurteilung der Symptome 3.4.5.2 Fragebogen zur objektiven Einschätzung durch die Patientenbesitzer 3.4.6 In-Vitro-Test (ELISA) 3.4.6.1 Prinzip des ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 3.4.6.2 Methode des eingesetzten ELISA 3.4.7 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Auswahl und Einsatz synthetischer Peptide für die Diagnostik und Therapie des equinen Sommerekzems 4.1.1 Arzneiliche Formulierung für den Intrakutantest 4.1.2 Arzneiliche Formulierung für die Intradermale Applikation 4.1.3 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation 4.2 Klinische Veränderungen infolge der SIT 4.2.1 Dermatitisgrad– Beurteilung des Hautbildes 4.2.2 Veränderte Symptomatik in der Studienlaufzeit – Einschätzung der Besitzer 4.3 Labordiagnostische Veränderungen infolge der SIT 4.3.1 Differentialblutbild 4.3.2 Ergebnisse des IgE-ELISA 4.3.3 Ergebnisse des IgG-ELISA 4.4 Vergleich der Werte des IgE ELISA mit den klinischen Symptomen (Score) 5 Diskussion 5.1 Einsatz synthetisch hergestellter Peptide in der Diagnostik und Therapie 5.2 Therapeutischer Einsatz synthetisch hergestellter Peptide für die intradermale Applikation 5.3 Etablierung einer Arzneiform für die sublinguale Therapie beim Pferd 5.4 Klinische Veränderungen in Folge der SIT 5.5 Therapiebegleitende Labordiagnostik 6 Zusammenfassung 7 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Tierkarte der Vorstudie mit klinisch gesunden Pferden 8.2 Besitzereinverständniserklärung und Datenschutzerklärung am Beispiel der Intradermalen Verabreichung 8.3 Tierkarte zur Erfassung des Gesundheitsstatus und Symptomentwicklung 8.4 Protokoll zur Durchführung des Intradermaltests 8.5 Protokoll zur Evaluierung des Dermatitisscores der an SE erkankten Pferde 8.6 Fragebogen zur Besitzerbefragung am Ende der Studie 8.7 Protokoll zur Durchführung eines ELISA am Beispiel der Untersuchung auf peptidspezifisches IgE im Patientenserum 9 Danksagung
The treatment options for horses suffering from Culicoides hypersensitivity are still often unsatisfac-tory. They are mainly reduced to symptomatic treatments and avoiding the allergy-triggering aller-gens. In various studies recombinant proteins were examined for their effectiveness on Culicoides hyper-sensitivity in horses. However, there are currently no oral preparations available in veterinary medicine for specific immunotherapy. Using Culicoides hypersensitivity as an example, a process for specific immunotherapy shall ulti-mately be developed in which the peptides can be used for both, the diagnosis and therapy od allergic diseases in veterinary medicine. The present study tool the first steps in this direction. For this purpose, an intracutaneously adminis-tered dosage form and a sublingually administered dosage form, which is new for horses, were used. Selected, synthetically produced peptides from mosquitoes of the genus Culicoides were ex-amined regarding their potential for specific immunotherapy in terms of their safety after application in horses in-vivo and their use in serology. Seven selected peptides, consisting of 30-35 amino acids, were used for in-vitro and in-vivo studies on healthy (n=6) and horses suffering from Culicoides hypersensitivity (n=12). After a test phase for tolerability in clinically healthy horses, the animals suffering from Culicoides hypersensitivity were randomly divided into two groups (intradermal and sublingual dosage forms). They were administered the respective dosage form for 21 weeks during the summer season with possible natural Culicoides exposure. During this time, the animals' health status was checked at regular intervals, in particular clinical symptoms, blood counts and the formation of specific antibodies were recorded. The skin appearance of the animals was assessed at weeks 1, 13 and 25 using a dermatitis score. The twelve most common areas on the horse's body affected by eczema were evaluated inde-pendently of each other. The owners of the animals were asked using a questionnaire about their opinion on the development or severity of their horse's clinical symptoms and well-being. To detect specific antibodies in the serum of the animals, using recombinant peptides as antigen, direct and indirect ELISAs were established for IgE and the IgG isotypes IgG1, IgG3/5 and IgG4/7. Furthermore, a commercial ELISA kit was used to examine the course of the total IgE concentration during the study period. Due to the small number of study participants and numerous invalid data from the ELISA studies, the statistical analysis was limited to descriptive analyses. Both types of application were well tolerated by the study participants. The administration of the sublingual tablet could be carried out by previously trained horse owners. At the start of the study, the dermatitis score was 14 points in the intradermal group and 13.67 points in the sublingual group. At the end of the study period, the average dermatitis grades were 40.33 and 38.50 points, respectively, and deteriorated during the course of this study. The owner survey revealed a slight improvement in symptoms compared to previous years. The level of total, free IgE in the test subjects' serum fell from 2.7 U/l to 2.1 U/l during the study period. In the animals in the intradermal application group, the free IgE was reduced by 0.8 U/l and in the sublingual group by 0.3 U/l. Peptide-based ELISA to determine different serum antibody isotypes binding the peptides could not be evaluated reliably. Peptide-specific IgE revealed individ-ual variations. Due to the lack of a control group without peptide application and conduction of the study during the season with uncontrolled, natural Culicoides exposure conclusions of effectiveness regarding clinical disease or serological effects cannot be drawn. The sublingual tablet developed was easy to use due to its shape, stability and handling and can be considered as an application method in veterinary medicine. The synthetic peptides were harmless and usable for in-vivo application. It remains reserved for future studies to further evaluate its diagnostic and therapeutic potential for use in equine Culicoides hypersensitivity and possibly other allergic diseases in horses. Due to limiting factors such as the very small number of study participants, the lack of a placebo group and the implementation during the exposure period, the present work is of a preliminary nature.:Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Allergie 2.1.1 Allergene 2.1.1.1 Charakteristika von Allergenen (Was macht eine Substanz zum Allergen) 2.1.1.2 Kreuzreaktivitäten 2.1.2 Typ-I-Allergie 2.1.2.1 Produktion sensibilisierender Antikörper bei Erstkontakt 2.1.2.2 Ausbildung allergischer Reaktionen bei Folgekontakt 2.1.3 Immunglobulin-System des Pferdes 2.1.4 Potenzielle Bedeutung der IgG-Isotypen bei verschiedenen Erkrankungen 2.2 Das Sommerekzem des Pferdes 2.2.1 Epidemiologie, Ätiologie und Pathogenese 2.2.2 Bedeutende Allergene 2.2.3 Diagnostische Ansätze 2.2.3.1 In-vivo-Test (Intradermal Test) 2.2.3.2 In-vitro-Tests 2.2.3.3 Nachweis von IgE 2.2.3.4 Funktionelle in-vitro-Tests 2.2.4 Therapeutische Ansätze 2.2.4.1 Vermeidung Allergenkontakte, medikamentöse Therapieversuche 2.2.4.2 Allergenspezifische Immuntherapie (ASIT) 2.2.4.3 Desensibilisierung mit nativen Allergenextrakten 2.3 Wechsel von Allergenextrakten auf die molekulare Ebene der Allergene - Bedeutung für Diagnostik und Therapie 2.4 Einsatz synthetischer Peptide in der ASIT 3 Geräte, Material und Methoden 3.1 Geräte 3.2 Material 3.2.1 Klinikbedarf 3.2.2 Laborbedarf 3.2.3 Reagenzien, Puffer und Lösungen 3.2.4 Allergene (Peptide) - Auswahl und Synthese 3.2.5 Antikörper 3.3 Tiere 3.3.1 Gesunde Kontrollgruppe 3.3.2 An Sommerekzem erkranke Studienteilnehmer 3.4 Methoden 3.4.1 Blutentnahme und weitere Verarbeitung 3.4.2 Herstellung der arzneilichen Formulierungen 3.4.2.1 Arzneiliche Formulierung für die intradermale Applikation 3.4.2.2 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation 3.4.3 Prüfung der Unbedenklichkeit an klinisch gesunden Pferden 3.4.3.1 Durchführung der Unbedenklichkeitsprüfung 3.4.3.2 Kontrollen des Gesundheitsstatus 3.4.4 Verabreichung der hergestellten Applikationslösungen an Patienten 3.4.4.1 In-Vivo-Test (Intradermaltest) 3.4.4.2 Intradermale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen 3.4.4.3 Orale Verabreichung der individuellen Peptidlösungen 3.4.5 Klinische Veränderungen infolge der SIT 3.4.5.1 Dokumentation und klinische Beurteilung der Symptome 3.4.5.2 Fragebogen zur objektiven Einschätzung durch die Patientenbesitzer 3.4.6 In-Vitro-Test (ELISA) 3.4.6.1 Prinzip des ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 3.4.6.2 Methode des eingesetzten ELISA 3.4.7 Statistik 4 Ergebnisse 4.1 Auswahl und Einsatz synthetischer Peptide für die Diagnostik und Therapie des equinen Sommerekzems 4.1.1 Arzneiliche Formulierung für den Intrakutantest 4.1.2 Arzneiliche Formulierung für die Intradermale Applikation 4.1.3 Arzneiliche Formulierung für die orale Applikation 4.2 Klinische Veränderungen infolge der SIT 4.2.1 Dermatitisgrad– Beurteilung des Hautbildes 4.2.2 Veränderte Symptomatik in der Studienlaufzeit – Einschätzung der Besitzer 4.3 Labordiagnostische Veränderungen infolge der SIT 4.3.1 Differentialblutbild 4.3.2 Ergebnisse des IgE-ELISA 4.3.3 Ergebnisse des IgG-ELISA 4.4 Vergleich der Werte des IgE ELISA mit den klinischen Symptomen (Score) 5 Diskussion 5.1 Einsatz synthetisch hergestellter Peptide in der Diagnostik und Therapie 5.2 Therapeutischer Einsatz synthetisch hergestellter Peptide für die intradermale Applikation 5.3 Etablierung einer Arzneiform für die sublinguale Therapie beim Pferd 5.4 Klinische Veränderungen in Folge der SIT 5.5 Therapiebegleitende Labordiagnostik 6 Zusammenfassung 7 Summary 7 Literaturverzeichnis 8 Anhang 8.1 Tierkarte der Vorstudie mit klinisch gesunden Pferden 8.2 Besitzereinverständniserklärung und Datenschutzerklärung am Beispiel der Intradermalen Verabreichung 8.3 Tierkarte zur Erfassung des Gesundheitsstatus und Symptomentwicklung 8.4 Protokoll zur Durchführung des Intradermaltests 8.5 Protokoll zur Evaluierung des Dermatitisscores der an SE erkankten Pferde 8.6 Fragebogen zur Besitzerbefragung am Ende der Studie 8.7 Protokoll zur Durchführung eines ELISA am Beispiel der Untersuchung auf peptidspezifisches IgE im Patientenserum 9 Danksagung
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