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Einleitung: Laut Schätzungen der WHO sind 150.000.000 Menschen mit einer chronischen Hepatitis C infiziert und 700.000 sterben jährlich an den Folgen der Erkrankung. Die antivirale Therapie der Vergangenheit wurde mittels Interferon alpha und Ribavirin durchgeführt. Diese Therapie war für die Patienten mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen verbunden und führte in vielen Fällen nicht zu einem anhaltenden virologischen Ansprechen (SVR) nach Therapieende. Seit Einführung der Direct Acting Antivirals (DAA) können in der Therapie der chronischen Hepatitis C SVR-Raten von über 90 % erreicht werden. Therapieversagen sind auf Resistance Associated Mutations (RAM) in der NS3-, NS5A- oder NS5B-Region zurückzuführen. Fragestellung: Die Entwicklung einer Methode zur genotypspezifischen Resistenztestung, die neben Forschungsaspekten vor allem auch für den Einsatz in der virologischen Diagnostik geeignet ist, ist Gegenstand dieser Arbeit. Aufgrund der Häufigkeitsverteilung der HCV-Genotypen in Deutschland wurde die Entwicklung einer Resistenztestungsmethode auf die Genotypen 1b, 1a und 3a eingegrenzt. Im Fokus dieser Arbeit standen die NS3-, NS5A- und NS5B-Regionen. An diesen Regionen greifen die DAAs in den Replikationszyklus ein. Material und Methoden: Zur Durchführung der Resistenztestung wurde sich für die nested- bzw. seminested-PCR entschieden. Nach reverser Transkription der viralen RNA und anschließender Amplifikation der entstandenen cDNA wurde eine präparative Gelelektrophorese durchgeführt. Spezifische Banden wurden manuell extrahiert, aufbereitet und nach der Sanger-Methode sequenziert. Die Sequenzen wurden mit Geneious dargestellt und ggf. manuell nachbearbeitet. Mittels geno2pheno-Onlinedatenbank wurden die Sequenzen auf vorhandene Resistenzmutationen gegenüber DAA untersucht. Es wurden 45 archivierte Serumproben der Genotypen 1a, 1b und 3a mit sich unterscheidender Viruslast und Vortherapie ausgewählt, um die Methode unter möglichst realistischen Untersuchungsbedingungen zu testen. Ergebnisse: Es wurden genotyp- und genlocusspezifische Primersequenzen und PCR-Protokolle für die drei viralen Genregionen NS3, NS5A und NS5B entworfen. Eine single-step-PCR war in vielen Fällen zur erfolgreichen Amplifikation nicht ausreichend, aus diesem Grund wurde die Resistenztestung mittels (semi)nested-PCR durchgeführt. Je nach Genotyp und Region konnten 86 – 100 % der Proben erfolgreich amplifiziert und sequenziert werden. Eine anschließend durchgeführte Resistenzanalyse erlaubte die Untersuchung von Trends bezüglich des Zusammenhangs zwischen der Art der Vortherapie und dem Auftreten von Resistenzmutationen. Eine statistische Auswertung war nicht Ziel dieser Arbeit und wurde aufgrund der geringen Probenanzahl nicht durchgeführt. Diskussion: Es gelang in dieser Arbeit ein Protokoll zu entwickeln, welches sich für HCV-Resistenzanalysen mit Einsatz in der klinisch-virologischen Diagnostik der in Deutschland häufigsten Genotypen 1a, 1b und 3a eignet. Erfreulicherweise wird dieses Protokoll zur HCV-Resistenztestung im Institut für Virologie des Universitätsklinikums Leipzig angewandt. Durch die nested-PCR können die Anteile der NS3-, NS5A- und NS5B-Regionen, die Resistenz-assoziierten Mutationen enthalten, sicher amplifiziert und sequenziert werden. Fehlamplifikationen sind am ehesten aufgrund von Punktmutationen an den Primerbindungsstellen zu erklären. Durch Selektionsdruck, fehlende proof-reading-Mechanismen und die Ungenauigkeit der Replikation durch die RNA-abhängige-RNA-Polymerase ist die Rate an Neumutationen bei HCV hoch. Eine wesentliche Option zur Verbesserung der HCV-Resistenztestung wäre die Entwicklung eines Protokolls, welches universell für alle Genotypen anwendbar ist.:1 Abkürzungsverzeichnis 4 2 Einleitung 5 2.1 Epidemiologie des Hepatitis C Virus (HCV) 5 2.2 Taxonomie und HCV-Genotypen 6 2.3 Genom, Replikation, Eintritt und Freisetzung 7 2.4 Klinische Symptomatik 10 2.5 Diagnostik 11 2.6 Therapie 12 2.6.1 Virologisches Ansprechen während und nach Therapie 12 2.6.2 Interferon: Therapie der Vergangenheit 13 2.6.3 Direct Acting Antiviral Agents 14 2.6.4 Unerwünschte Arzneimittelreaktionen, Arzneimittelinteraktionen und HCC-Risiko 16 2.6.5 DAA Resistenzmutationen 17 2.6.6 Indikationen zur Resistenzanalyse 18 3 Fragestellung 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Geräte und Verbrauchsmittel 20 4.2 Reaktionskits 21 4.3 Reagenzien 21 4.4 Primer 22 4.5 Patienten 22 4.5.1 Proben 22 4.5.2 Ethikvotum 24 4.6 RNA Extraktion aus Serum oder Plasma 25 4.7 RT Reaktion 26 4.8 PCR 27 4.9 Agarosegelelektrophorese 29 4.10 Gelextraktion 31 4.11 Sequenzierung 31 5 Ergebnisse 33 5.1 Primerdesign 33 5.2 Optimierung des PCR Protokolls 36 5.2.1 Optimierung der RT-Reaktion 36 5.2.2 Optimierung der PCR: nested und seminested PCR 37 5.3 Amplifikation der Proben 39 5.4 Sequenzauswertung und Resistenzanalyse 42 5.5 Vorhandene Resistenzmutationen 46 5.5.1 Mutationen sortiert nach Region 46 5.5.2 Mutationen sortiert nach Gruppen 48 6 Diskussion 50 6.1 Einsatz der Methode in der klinischen Diagnostik 50 6.1.1 Erfolgreiche Amplifikation von Therapieresistenzen 50 6.1.2 Auswahl der Nachweismethode 50 6.1.3 Kriterien einer guten diagnostischen Nachweismethode 51 6.1.4 Verbesserungsmöglichkeiten 52 6.1.5 Zeitpunkt des Einsatzes der Hepatitis C Resistenztestung 53 6.2 Probleme und Fehleranalyse 54 6.2.1 Probleme bei der Recherche 54 6.2.2 Gründe für eine erfolglose Amplifikation 54 6.2.3 Primerannealing 55 6.2.4 Genotypen 56 6.3 Prävalenzen von Therapieresistenzen 57 6.4 Ethische Problematik: Hohe Therapiekosten nach Zulassung verhinderten den Zugang zu adäquater DAA-Therapie 59 7 Zusammenfassung 62 8 Literaturverzeichnis 65 9 Tabellenverzeichnis 69 10 Abbildungsverzeichnis 69 11 Anlagen 70 11.1 Resistenzmutationen 70 12 Selbstständigkeitserklärung 73 13 Danksagung 74 |
