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Die Charakterisierung (epithelialer-) Neoplasien und deren Metastasen hinsichtlich ihres Ursprungsgewebes, sowie die Frage nach der biologischen Wertigkeit von Proliferationsprozessen, wie z.B. Hyperplasien, Polypen und Neoplasien, stellt eine der Kernanforderungen der heutigen Zeit an den praktisch tätigen Veterinär-Pathologen dar. Zu den Goldstandards der angewandten weiterführenden Untersuchungen hierfür zählt der immunhistologische Nachweis von Zytokeratinen. Dabei handelt es sich um zu den Intermediärfilamenten zählende Strukturproteine überwiegend epithelialer Zellen, die sowohl in gesunden als auch in neoplastisch entarteten Geweben vorkommen. Obwohl der immunhistologische Nachweis von Zytokeratinen seit langem in der Veterinär-Pathologie diagnostisch genutzt wird, liegen Untersuchungen zu deren detaillierter Expression in allen Organen des Hundes, im Gegensatz zur Humanmedizin, bisher nicht vor. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die epithelspezifische Diversität der Zytokeratine für die Normalgewebe des Hundes zu katalogisieren, um sie analog zur Humanmedizin als diagnostisches Hilfsmittel besser nutzbar zu machen. Hierfür wurden 42 Normalgewebe des Hundes hinsichtlich ihrer Zytokeratinexpression untersucht und eine Gewebegruppierung nach Reaktionsmuster vorgenommen, aus der ein Differenzierungsstammbaum der untersuchten epithelialen Zellpopulationen erarbeitet wurde. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 3360 immunhistologisch aufbereitete Proben lichtmikroskopisch untersucht. Dabei handelt es sich um 42 unterschiedliche kanine Normalgewebe, bei einer Stichprobenzahl von zehn (n=10), welche jeweils mit 8 unterschiedlichen antihumanen Antikeratin-Antikörpern untersucht wurden (42*10*8=3360). Die Gewebe stammten von 48 frischtoten Hunden aus dem Probengut des Institutes für Veterinär-Pathologie, Universität Leipzig und wurden routinemäßig Formalinfixiert. Für die immunhistologische Aufarbeitung wurden 8 Antikeratin-Antikörper verwendet (CK 10, 14, 15, 16, 19 (AE1) / CK 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 (AE3), CK 7 (OVFL12/30), CK 8 (NCL-CK8-TS1), CK 13 (AE 8), CK 14 (NCL-LL002CK), CK 17 (E3). 19 (NCL-CK19), sowie CK 20 (Clone Ks 20.8)). Die Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch, die Ergebnisse wurden deskriptiv sowie semi-quantitativ, mittels ‚Immunoreaktiven Scores (IRS)‘ und prozentualer Färbeintensität gewonnen. Die statistische Auswertung der erhobenen Datensätze (IRS/Färbeintensität) erfolgte deskriptiv für jede Gewebestruktur unter Berücksichtigung 98 der minimalen und maximalen Expression, Mittelwert (M), Median (m), Standardabweichung und Differenz M-m, sowie graphischer Darstellung als Säulendiagramm. Die im Rahmen dieser Studie erhobenen Befunde korrelieren weitestgehend mit den aus der Literatur für den Menschen bekannten Zytokeratinexpressionsmustern. Unterschiede finden sich für die kaninen CK 13, CK 14, CK 17 und CK 20. Keratin 13 kommt beim Hund in den basalen Schichten von allen Plattenepithelien und respiratorischem Epithel vor. Für CK 14 kann keine Reaktion in kaninen sekretorischen Zellen beobachtet werden. Das hier erstmals detailliert beschriebene Vorkommen von CK 17 beim Hund beschränkt sich auf Übergangsepithelien. Die Expression von CK 20 kann beim Hund in einer deutlich größeren Anzahl von Geweben als beim Menschen dokumentiert werden. Als intrazelluläres Verteilungsmuster der Reaktionsprodukte wird ein diffus-intrazytoplasmatisches, membranständiges, sowie gemischtes Vorkommen beobachtet. Basierend auf ihrer Zytokeratinexpression kann folgende Gewebegruppierung erfolgen: Respiratorisches Epithel (AE1/AE3, CK 7, CK 8, CK 19, basal zusätzlich CK 13), Urothel (AE1/AE3, CK 7, CK 8, CK 13, CK 19 und CK 20), Gastrointestinale Epithelien (AE1/AE3, CK 8, CK 19, CK 20), Übergangsepithel (AE1/AE3, CK 13, CK 14, CK 17, CK 19), mehrschichtiges Plattenepithel (AE1/AE3, basal CK 13, CK 14), Talgdrüsen (AE1/AE3, CK 8, CK 13, 14), Schweißdrüsen (AE1/AE3, CK 7, CK 8, CK 19), Myoepithelien (AE1/AE3, CK 14, CK 19) und Gewebe ohne Reaktion (Milz, Nebenniere, Nebenschilddrüse, Ependym, Gehirn, Fibroblasten/Fibrozyten, Adipozyten, Blutzellen, Endothelien, Synoviozyten). Weiterhin zeigen endokrin-aktive Zellen eine Expression von CK 13 und CK 20, basale Stammzellen eine Expression von CK 13 und CK 14, sowie Übergangsepithelien eine Expression von CK 17. Alle acht verwendeten monoklonalen Antikörper gegen humane Zytokeratine zeigen eine hohe Sensitivität und Spezifität in kaninen, formalinfixierten Normalgeweben. Bei der Verwendung eines Markers gegen CK 7 (OV-TL12/30) sollte die Fixierdauer in Formalin 3 Tage nicht überschreiten, da sonst eine Beeinträchtigung der Reaktion eintritt. Bei der Tierart Hund treten große individuelle Schwankungen in der Expression der untersuchten Zytokeratine in allen Geweben auf, was bei der diagnostischen Nutzung der Antikörper berücksichtigt werden muss. Bei der verwendeten Methode (Immunhistologie) handelt es sich um ein einfaches, sicheres und praxistaugliches indirektes Nachweisverfahren zur Bestimmung kaniner Zytokeratine mittels monoklonaler antikeratin-antihuman-Antikörper. Unter Verwendung des vorgeschlagenen Antikörperpanels lassen sich mittels etablierten Differenzierungsschemas 23 der 42 kaninen Gewebe sicher immunhistologisch differenzieren. Inwieweit die in dieser Studie an kaninen Normalgeweben gewonnenen Ergebnisse auch zur weiterführenden Charakterisierung epithelialer Neoplasien des Hundes eingesetzt werden können, muss in Folgearbeiten geklärt werden.:1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Epidemiologie neoplastischer Erkrankungen in der Veterinärmedizin 2 2.2 Zytokeratine 2 2.2.1 Einteilung der Zytokeratine 2 2.2.2 Physikalische und chemische Eigenschaften 3 2.2.3 Funktion der Zytokeratine 4 2.2.4 Ultrastruktureller Aufbau 5 2.2.5 Genetische Kodierung 5 2.2.6 Bekannte Zytokeratinexpression des Menschen 6 2.2.6.1 Normalgewebe 6 2.2.6.2 Neoplasien 8 2.2.7 Bekannte Zytokeratinexpression des Hundes 9 2.2.7.1 Normalgewebe 9 2.2.7.2 Neoplasien 2.3 Ursachen für Reaktionsintensitätsschwankungen in der Immunhistochemie 2.3.1 Auswirkung der Formalinfixierung 2.3.2 Andere bekannte Ursachen 2.4 Zusammenfassung und Fazit aus der Literatur 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Tiergut, Material und Probenherkunft 3.1.1 Tierart und Tiergut 3.1.2 Auswahl der Zielorgane 3.1.3 Probenentnahme und Fixierung 3.2 Probenaufbereitung, histologische Präparation und Gewebeauswahl 3.2.1 Probenaufarbeitung und histologische Präparation 3.2.2 Gewebeauswahl 3.3 Lichtmikroskopische Untersuchungen 3.4 Immunhistologische Untersuchungen 3.4.1 Verwendete Antikörper 3.4.2 Vorversuche 3.4.3 Hauptversuch 3.4.4 Immunhistologische Kontrollen, Färbesystem und Verstärkersystem 3.5 Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen 3.6 Statistische Auswertungen 4 ERGEBNISSE 4.1 Gewebeübersicht Immunoreaktiver Score (IRS) 4.2 Immunhistologische Reaktion der untersuchten Zytokeratine in den einzelnen Geweben 4.2.1 Atmungsapparat 4.2.1.1 Nase (Nasus externus) 4.2.1.2 Nasenmuschel (Conchae nasalis) 4.2.1.3 Luftröhre (Trachea) 4.2.1.4 Lunge (Pulmones) 4.2.2 Verdauungsapparat 4.2.2.1 Wange (Labia buccalis) 4.2.2.2 Zahnfleisch (Gingiva) 4.2.2.3 Zunge (Lingua) 4.2.2.4 Ohrspeicheldrüse (Glandula parotidea) 4.2.2.5 Speiseröhre (Oesophagus) 4.2.2.6 Magen (Ventriculus) 4.2.2.7 Dünndarm (Intestinum tenue) 4.2.2.8 Dickdarm (Intestinum crassum) 4.2.2.9 Enddarm und Anus (Rectum und Canalis analis) 4.2.2.10 Leber (Hepar) 4.2.2.11 Gallenblase (Vesica fellea) 4.2.2.12 Bauchspeicheldrüse (Pancreas) 4.2.3 Harnapparat 4.2.3.1 Niere (Ren) 4.2.3.2 Harnblase (Vesica urinaria) 4.2.4 Männliches Genitale 4.2.4.1 Hoden (Testis) 4.2.4.2 Nebenhoden (Epididymis) 4.2.4.3 Vorsteherdrüse (Glandula prostatica) 4.2.4.4 Männliches Glied (Penis) 4.2.5 Weibliches Genitale 4.2.5.1 Eierstock (Ovar) 4.2.5.2 Eileiter (Salpinx) 4.2.5.3 Gebärmutter (Uterus) 4.2.5.4 Gebärmutterhals (Cervix uteri) 4.2.5.5 Scheide (Vagina) 4.2.6 Haut und Anhangsorgane 4.2.6.1 Haut (Integumentum commune) 4.2.6.2 Augenlid (Palpebra superior) 4.2.6.3 Ceruminaldrüsen (Glandulae ceruminosae) 4.2.6.4 Milchdrüse (Mamma) 4.2.7 Lymphatische Organe 4.2.7.1 Thymus 4.2.7.2 Milz (Lien) 4.2.7.3 Gaumenmandel (Tonsilla palatina) 4.2.8 Hormondrüsen (endokrine Drüsen) 4.2.8.1 Hirnanhangsdrüse (Glandula pituitaria) 4.2.8.2 Nebenniere (Glandula adrenalis) 4.2.8.3 Schilddrüse (Glandula thyroidea) 4.2.8.4 Nebenschilddrüse (Glandula parathyroidea) 4.2.9 Innere Oberflächen 4.2.9.1 Meningothel 4.2.9.2 Plexus choroideus/Ependym 4.2.9.3 Serosa 4.2.9.4 Synovialmembran des Kniegelenkes (Membrana synovialis genu) 4.3 Färbeintensität 4.4 Zusammenfassung der Ergebnisse zur Zytokeratinexpression für die Spezies Hund 4.4.1 Gruppierung der untersuchten Gewebe nach Reaktionsmuster 4.4.2 Differenzierungsschema 5 DISKUSSION 5.1 Kritischer Vergleich der Ergebnisse beim Hund mit der vorhandenen Literatur 5.2 Vergleichende Betrachtung der Zytokeratinexpression von Hund und Mensch 5.3 Fehleranalyse und Methodik 5.3.1 Methode und Fixation 5.3.2 Sensitivität/Spezifität 5.3.3 Bewertung der einzelnen verwendeten Marker 5.4 Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 LITERATURVERZEICHNIS 9 ANHANG 9.1 Verfahrensschritte Fixierung 9.1.1 Herstellung 4%iges gepuffertes Formalin 9.1.2 Fixierdauer 9.2 Verfahrensschritte der immunhistologischen Untersuchungen 9.2.1 Vorbehandlung 9.2.2 Besondere Verfahren 9.2.3 Antigennachweis mittels monoklonaler Antikörper nach der PAP-Methode 9.2.5 Standard zum Nachweis mittels Histofine© Verstärkersystem 9.2.6 Verwendete Antikörper und Seren 9.2.7 Lösungen und Puffer 9.3 Für die Immunhistologie verwendete Positivkontrollen und Primärantikörper A - 6 9.4 Tabellen 9.5 Abbildungen 9.5.1 Nase (Nasus externus) 9.5.2 Nasenmuschel (Conchae nasalis) 9.5.3 Luftröhre (Trachea) 9.5.4 Lunge (Pulmones) 9.5.5 Wange (Labia buccalis) 9.5.6 Zahnfleisch (Gingiva) 9.5.7 Zunge (Lingua) 9.5.8 Ohrspeicheldrüse (Glandula parotidea) 9.5.9 Speiseröhre (Oesophagus) 9.5.10 Magen (Ventriculus) 9.5.11 Dünndarm (Intestinum tenue) 9.5.12 Dickdarm (Intestinum crassum) 9.5.13 Enddarm und Anus (Rectum und Canalis analis) 9.5.14 Leber (Hepar) 9.5.15 Gallenblase (Vesica fellea) 9.5.16 Bauchspeicheldrüse (Pankreas) 9.5.17 Niere (Ren 9.5.18 Harnblase (Vesica urinaria) 9.5.19 Hoden (Testis) 9.5.20 Nebenhoden (Epididymis) 9.5.21 Vorsteherdrüse (Prostata) 9.5.22 Männliches Glied (Penis) 9.5.23 Eierstock (Ovar) 9.5.24 Eileiter (Salphinx) 9.5.25 Gebärmutter (Uterus) 9.5.26 Gebärmutterhals (Cervix uteri) 9.5.27 Scheide (Vagina) 9.5.28 Haut (Integumentum commune) 9.5.29 Augenlid (Palpebra superior) 9.5.30 Ceruminaldrüsen (Glandulae ceruminosae) 9.5.31 Milchdrüse (Mamma) 9.5.32 Thymus 9.5.33 Milz (Lien) 9.5.34 Gaumenmandel (Tonsilla palatina) 9.5.35 Hirnanhangsdrüse (Glandula pituitaria) 9.5.36 Nebenniere (Glandula adrenalis) 9.5.37 Schilddrüse (Glandula thyroidea) 9.5.38 Nebenschilddrüse (Glandula parathyroidea) 9.5.39 Meningothel 9.5.40 Plexus choroideus/ Ependym 9.5.41 Serosa 9.5.42 Synovialmembran des Kniegelenkes (Membrana synovialis genu) 9.6 Diagramme 9.6.1 Färbeintensität der einzelnen Individuen, getrennt nach Markern 9.6.2 Einteilung der Färbeintensität in Abhängigkeit von der Fixierdauer in Formalin, getrennt nach Markern |
