Исследование влияния рекомбинантного аполипопротеина А-I на работу сердечной мышцы в эксперименте

Autor: Р. Князев, Н. Трифонова, А. Рябченко, М. Котова, А. Колпаков, Л. Поляков
Jazyk: English<br />Russian
Rok vydání: 2018
Předmět:
Zdroj: Патология кровообращения и кардиохирургия, Vol 22, Iss 4 (2018)
Druh dokumentu: article
ISSN: 1681-3472
2500-3119
DOI: 10.21688/1681-3472-2018-4-88-94
Popis: Введение. Ранее установлено, что липопротеины высокой плотности плазмы крови крыс увеличивают частоту и силу сокращения изолированного сердца крысы. На этой модели основной белковый компонент липопротеинов высокой плотности аполипопротеин А-I, выделенный из плазмы крови человека, увеличивал силу сокращений сердца, мало влияя на частоту. Разработанная в НИИ биохимии методика получения рекомбинантного аполипопротеина А-I позволяет значительно расширить исследования кардиотропных свойств данного белка. Цель. Изучить влияние рекомбинантного аполипопротеина А-I на показатели работоспособности изолированного сердца крысы, сравнив его с действием нативного аполипопротеина А-I. Методы. Эксперименты проведены на крысах-самцах Вистар массой 250–300 г. Изолированные сердца крыс перфузировали ретроградно по стандартной методике с регистрацией изоволюмического давления в левом желудочке. Рекомбинантный аполипопротеин А-I человека был получен в клетках E. coli в виде химерного полипептида, с последующим превращением белка в зрелую форму рекомбинантного аполипопротеина А-I. Результаты. Показано, что рекомбинантный аполипопротеин А-I в концентрации 20 мкг/мл вызывал стабильное повышение давления в левом желудочке, при этом величина коронарного потока и частота сердечных сокращений менялись незначительно. Максимальный инотропный эффект был зарегистрирован на 20 мин от начала перфузии и составил 147,5% относительно контрольных значений. Установлено, что в присутствии рекомбинантного аполипопротеина А-I увеличивалась максимальная скорость сокращения левого желудочка. При этом временной отрезок диастолы имел тенденцию к увеличению и был больше, по сравнению с исходными данными, на 10-й и 20-й мин перфузии. Выводы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о функциональной аналогии кардиотонического действия рекомбинантного аполипопротеина А-I по сравнению с его нативной формой. Однако механизм реализации инотропного эффекта требует дальнейшего изучения. Введение Возросший в настоящее время интерес исследователей к липопротеинам сыворотки крови в значительной степени обусловлен открытием разнообразных биологически важных внесосудистых свойств липопротеинов и их белковых компонентов — аполипопротеинов. В частности, установлена роль липопротеинов в стероидогенезе [1], раскрыты механизмы участия липопротеинов очень низкой плотности в комплексе со стероидными гормонами в усилении биосинтеза белка и дезоксирибонуклеиновой кислоты в опухолевых клетках [2], обнаружен контринсулярный эффект аполипопротеина В [3]. В последние годы опубликованы результаты исследований, показывающие защитное действие нативных липопротеинов высокой плотности и синтетических частиц, содержащих апоА-I, при повреждении миокарда в результате ишемии или реперфузии изолированного сердца крысы [4–6]. Ранее мы провели исследование влияния всех классов липопротеинов плазмы крови крыс на работу изолированного по Лангендорфу сердца крысы. В этих экспериментах постоянное и выраженное увеличение частоты и силы сердечных сокращений проявлялось у липопротеинов высокой плотности, которые устраняли негативное влияние адреналина на сердце при длительной перфузии [7]. В последующем на такой же модели обнаружено кардиотоническое действие аполипо­протеина А-I (апоА-I), полученного из крови доноров. В отличие от липопротеинов, аполипопротеин не влиял на частоту сокращений [8]. Изучение нативных белков плазмы крови связано с трудностями их получения в необходимых для исследования количествах. Развитие биотехнологии позволило решить эту проблему. В литературе представлены работы по реконструированию липопротеиновых частиц [4]. Проведен структурно-функциональный анализ целого ряда различных модификаций аполипопротеина А-I с целью выяснения механизмов их антиатерогенной активности [9]. Однако, как показали исследования, даже небольшие изменения в структуре апоА-I могут приводить к появлению патогенных свойств этого белка [10]. Данная работа посвящена исследованию полученного в НИИ биохимии рекомбинантного аполипопротеина А-I (рапоА-I) на показатели работоспособности изолированного сердца крысы с целью определения возможности данного протеина выступать в качестве кардиотонического соединения. Методы Эксперименты на лабораторных животных проводили в соответствии с приказом Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755 и приложение к приказу № 565 от 04.10.1977 г.) «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», согласно принципам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000 г.). Животные содержались на стандартной диете и имели свободный доступ к воде. Представленная работа одобрена комитетом по биоэтике НИИ биохимии № 5/1 от 14.11.2017 г. Работа выполнена на крысах-самцах Вистар массой 250–300 г. Исследования проведены на изолированном по Лангендорфу, сокращающемся сердце крысы по стандартной методике с регистрацией давления в левом желудочке. Перфузионное давление составило 60 мм рт. ст. Представленная работа является частью большого исследования, посвященного изучению роли липопротеинов высокой плотности и их основного белкового компонента аполипопротеина А-I в регуляции работы изолированного сердца [7, 8]. Более подробное методическое описание представлено в ранее опубликованной работе [8]. Определяли следующие показатели: частоту сердечных сокращений (ЧСС), коронарный поток (КП), давление в левом желудочке. Показатель работоспособности миокарда (Р) рассчитан как произведение давления на частоту сокращений в минуту. Отношение выполненной работоспособности к величине коронарного потока (Р/КП) определяло эффективность сократительной функции миокарда. Максимальную скорость увеличения давления (+dP/dt) и максимальную скорость падения давления (-dP/dt) мио­карда рассчитывали как отношение dP/dt [11]. Рекомбинантный аполипопротеин А-I (рапоА-I) человека был получен в клетках E. coli в виде химерного полипептида, с последующим превращением белка в зрелую форму рапоА-I. Проверка чистоты апоА-I осуществлялась с помощью электрофореза в 10% поли­акриламидном геле с Ds-Na. Белковые полосы визуализировали 0,1% Кумасси G-250 в смеси метанола и 10% уксусной кислоты (1:1). В качестве маркеров использовали набор низкомолекулярных белков-стандартов 10–80 кДа «Сибэнзим» (Россия), рис. 1. Подробно способ получения и очистки рапоА-I описан в нашей работе [12]. Фракцию, содержащую рапоА-I, разбавляли до 1 о.е./мл буфером, содержащим мочевину, и обессоливали диализом в фосфатно-солевом буфере. На заключительном этапе раствор белка стерилизовали фильтрованием, диаметр пор 0,22 мкм (Syringe-DivenFilters, Jet Biofilm, Корея), хранили при 4 °С и использовали в течение 3–5 дней. Концентрация обессоленного белка составляла 1,0 мг/мл. Дизайн Перфузию проводили в присутствии рапоА-I с концентрацией 20 мкг/мл. Количество животных в каждой группе составило восемь особей. Каждое выделенное сердце работало до установления стабильных показателей давления в левом желудочке и частоты сердечных сокращений без рециркуляции перфузионного давления. Время перфузии в условиях стабилизации показателей составило 15–20 мин. После этого проводили измерение исходных показателей (давление в левом желудочке, ЧСС, Р, Р/КП). Сердце работало в течение 30 мин. Данные работоспособности представлены для 5, 10, 20, 30 мин. Исходные (контрольные) показатели работы сердца крысы различались между собой, поэтому изменения в работе миокарда под влиянием изучаемых компонентов оценивали в процентах по отношению к исходным показателям [8]. Статистический анализ Проверку нормальности распределения данных в группах выполнили с помощью критерия Колмогорова – Смирнова. Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента корреляции r-Спирмена. Дисперсию признака в выборках проверяли с помощью критерия F-Фишера. Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок при уровне значимости p
Databáze: Directory of Open Access Journals
Externí odkaz: