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Introdução: RhoA e RhoC são proteínas homólogas que participam de processos celulares controlados por p53, como o reparo a danos no DNA. RhoA e RhoC atuam na promoção do desenvolvimento tumoral, porém suas funções em células leucêmicas não foram exploradas. Objetivos: Neste estudo, padronizamos o tratamento com luz UVC em linhagens mieloides. Os efeitos do silenciamento de RhoC na indução de danos ao DNA causados por UVC também foram avaliados. Materiais e métodos: As densidades de energia da radiação UVC (10-80 J/m2) foram padronizadas utilizando o ensaio de MTT nas linhagens celulares OCI-AML3 (TP53 selvagem) e U937 (TP53 mutado) por 24, 48 e 72 horas. Após a determinação das intensidades de UVC, a expressão de p53, RhoA e RhoC foi avaliada por Western blot. O silenciamento de RhoA e RhoC foi realizado com lentivírus nas células U937. O ciclo celular e a expressão de γH2AX (marcador de dano no DNA) foram avaliados por citometria de fluxo. Resultados: O tratamento com UVC reduziu a viabilidade das linhagens celulares. Os IC50 (índices que representam 50% de inibição) de células OCI-AML3 e U937 foram respectivamente 20 e 10 J/m2 em 48 horas. Estas doses foram utilizadas nos experimentos subsequentes. Houve aumento e posterior redução de p53 e RhoA nas células OCI-AML3 após as primeiras horas de irradiação. A expressão de RhoC, por sua vez, reduziu gradativamente. Em células U937, RhoA também apresentou aumento e posterior redução, enquanto a expressão de RhoC não foi alterada após a irradiação. Observamos um aumento gradativo da população de células OCI-AML3 na fase G1 do ciclo celular após a irradiação, enquanto células U937 apresentaram aumento nas fases G1 e G2/M. Esse aumento foi acompanhado pela indução de γH2AX. Após 24 horas, a expressão de γH2AX foi reduzida em células OCI-AML3 e manteve-se alta em U937. O silenciamento de RhoA e RhoC foi efetivo nas células U937 (redução da expressão gênica e proteica de 85%). Porém, o silenciamento de RhoA resultou no bloqueio da proliferação celular, impedindo a realização de ensaios. Houve aumento da população de U937 na fase G1 do ciclo celular tanto na cultura de células shCTRL quanto em shRhoC. Interessantemente, as células silenciadas para RhoC apresentaram menor expressão de γH2AX após radiação com UVC em comparação ao controle. Discussão: Nossos dados indicam que células OCI-AML3 e U937 apresentam diferentes respostas no ciclo celular e marcação de γH2AX frente à irradiação UVC, o que pode estar relacionado ao status mutacional de TP53. O aumento e posterior redução de p53 em células OCI-AML3 após a exposição à UVC indica que foi utilizada uma baixa dose de radiação. A alteração na expressão de RhoA e RhoC induzida por UVC sugere que estas proteínas estejam envolvidas na resposta a danos no DNA. De fato, células silenciadas para RhoC apresentaram menor marcação de γH2AX em comparação às celulas controle. Conclusão: Neste trabalho, foram estabelecidas as doses de UVC que induzem danos ao DNA de forma moderada em células U937 e OCI-AML3, com parada no ciclo celular. O tipo de resposta celular parece ser dependente do status mutacional de p53. Nosso estudo mostra, pela primeira vez, a alteração da expressão de RhoA e RhoC após a irradiação UVC em linhagens mieloides e que o silenciamento de RhoC reduz a marcação de γH2AX induzida por UVC. Financiamento: FAPESP. |
