P1 transdüksiyon yöntemi ile birden fazla gen bakımından mutant olan Escherichia coli suşlarının elde edilmesi

Autor: DİBEK, Esra, SEZER KÜRKÇÜ, Merve, ÇİFTÇİ, Begüm Hazar, ÇÖL, Bekir
Jazyk: turečtina
Rok vydání: 2019
Předmět:
Zdroj: Volume: 9, Issue: 1 110-119
Bitlis Eren Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi
ISSN: 2147-3129
2147-3188
Popis: Assigning genefunctions and performing phenotypic studies of the bacteria require theconstruction of specific mutants that at times should lack more than one genedue to the redundancy of particular gene activities. P1 phage is a generalizedtransducing phage that can be used in constructing double, triple or multiplemutants of Escherichia coli. Thisphage is able to mistakenly package random fragments of E. coli chromosome (~2 % of the genome into each particle) into thephage head during phage development. Thephages with E. coli DNA can injectthat DNA into recipient cells. Given homology between donor and recipient, anda selectable marker, transductants can be obtained. For transduction, avirulent derivative of phage P1 is preferably used because this form cannotintegrate into the bacterial genome. The virulent phage can only develop usingthe lytic mode of development and produces phage progeny upon lysis of the hostcell. This technique is based on recombination technology, allowing the DNAfragments of the E. coli genome to betransported among the strains.In this study,we optimized the P1 transduction methodology, which we aim to present to theTurkish scientific community in the native language with the experimental flowand sufficient details. For this reason, a number of four single gene mutantsobtained from the KEIO collection were used. First, kanamycine (Kan) genecassettes were removed from each mutant strain to create a recipient strainthat is kan sensitive. The other four KEIO mutant strains with KanRcassettes were used as the donor strains and P1 phage were cultured with thesestrains and the lysates were obtained. These lysates and recipient strains werethen transduced to integrate the DNA fragments of the lysates into therecipient strain genome. Upon selection with kanamycine, new mutant strains,double mutants are obtained. As a result, four double mutants namely DtsgAugpA, DyhdTompA, DugpAmdtG and DaroGmalF were obtained and the details pertaining to theprotocols and results are presented and discussed.
Bakterilerdegen fonksiyonlarının bulunması ve fenotipik çalışmalarının yapılabilmesi içinmutantların oluşturulması gerekmektedir. Bazı durumlarda, birden fazla genaçısından mutant olan suşlar oluşturulmalıdır çünkü bazı spesifik aktivitelerbirden fazla gen tarafından kodlanmaktadır. P1 fajı, Escherichia coli'de, ikili, üçlü veya çoklu mutantlarınoluşturulmasında başvurulan, genelleştirilmiş bir transdüksiyon fajıdır. Bufaj, gelişimi sırasında, E. coli kromozomununparçalarını (her bir partikülde genomun yaklaşık % 2'si olmak üzere), rastgelebir şekilde faj kafasına paketleyebilmektedir. E. coli DNA’sını içeren fajlar, içerdikleri DNA parçalarını, alıcıbakteri hücrelerine enjekte edebilmektedir. Verici ve alıcı DNA bölgeleriarasındaki benzerlik ve seçici bir markır yardımıyla, transdüktanlar’ın eldeedilmesi mümkün olmaktadır. Transdüksiyon için tercihen, P1 fajının, virülanbir türevi (P1vir) kullanılmaktadır, çünkü bu form, bakterinin genomuna entegreolamamaktadır. Fajın bu özelliğinin kullanılmasıyla geliştirilen tekniklerdenbirisi, P1 transdüksiyon tekniği olarak adlandırılmaktadır. Rekombinasyonteknolojisinde kullanılan bu teknik, E.coli genomuna ait DNA parçalarının, suşlar arasında taşınmasınısağlamaktadır.Buçalışmada, optimize ettiğimiz P1 transdüksiyon metodolojisinin, deneysel akışve yeterli detaylarla birlikte, Türk bilim camiasına, ana dilimizde sunulmasıamaçlanmıştır. Bunun için, KEIO koleksiyonundan elde edilen dört adet tekli genmutantları kullanılmıştır. İlk olarak, kanamisin (Kan) duyarlı bir alıcı suşoluşturmak için, her bir mutant suştan, Kan gen kasetleri çıkarılmıştır. KanRkasetlerine sahip diğer dört adet KEIO mutant suşu, donör suşlar olarakkullanılmış ve P1 fajı bu suşlar ile kültür edilerek, lizatlar elde edilmiştir.Bu lizatlar ve alıcı suşlar daha sonra, lizatlardaki fazjların içerdikleri DNAparçalarını, alıcı suş genomuna entegre edebilmesi için, transdüksiyona tabiitutulmuştur. Kanamisin ile seleksiyon sonucu, yeni mutant suşlar olan ikilimutantlar elde edilmiştir. Sonuçta, isimleri DtsgAugpA, DyhdTompA, DugpAmdtGve DaroGmalF olan, dört adetikili mutant oluşturulmuştur. Deneysel akıştaki ilgili protokoller ve sonuçlaraait detaylar sunulmuş ve tartışılmıştır.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: