Разработка и валидация высокоинформативного иммуноферментного анализа для определения свободного простат-специфического антигена

Autor: Komar, Anatolii, Kozerecka, Oksana, Besarab, Olexandr, Galkin, Alexander
Jazyk: ukrajinština
Rok vydání: 2019
Předmět:
Zdroj: Innovative Biosystems and Bioengineering; Том 3, № 4 (2019); 220-231
ISSN: 2616-177X
Popis: Проблематика. Простат-специфічний антиген (PSA) є ключовим маркером, що використовується в моніторингу пацієнтів із гіперплазією передміхурової залози, ризиком розвитку та раком передміхурової залози. Клінічна лабораторна діагностика для такого роду пацієнтів реалізується із використанням відповідних серологічних тестів. Засоби імуноферментної діагностики являють собою біоаналі­тичні продукти, на які поширюються вимоги щодо медичних виробів для діагностики in vitro. Таким чином, актуальною задачею сучасної аналітичної біотехнології є покращення біоаналітичних і техніко-економічних показників діагностичних наборів, а також їх валідація як передумова допуску такого роду продукції на ринок.Мета. Наукове обґрунтування складу і технології отримання високоінформативного імуноферментного аналізу (ІФА) для кількісного визначення вільного PSA у сироватці (крові) людини, а також його біоаналітична валідація на момент виготовлення та закінчення строку придатності.Методика реалізації. Для конструювання ІФА використовували раніше отриманий та охарактеризований набір моноклональних антитіл (мАт) до різних епітопів PSA. Пероксидазні кон’югати мАт синтезували методом періодатного окиснення. У роботі використано 1-й міжнародний стандарт PSA Всесвітньої організації охорони здоров’я (WHO International Standard Prostate Specific Antigen) та сироватки крові людей із різним вмістом PSA. Валідацію розробленого ІФА проводили за загальноприйнятою схемою, що застосовується для кількісних біоаналітичних методик.Результати. На першому етапі роботи було проведено визначення оптимальної конфігурації мАт для розробки неконкурентного “сендвіч”-варіанта ІФА. Досліджувані мАт були охарактеризовані за такими показниками: активність у ІФА (відносно PSA, його комплексу з α1-антихімотрипсином (α1-ACT) та спорідненого білка каллікреїну-2), ізотип, титр, константа афінності, порівняльна епітопна специфіч­ність, ступінь інгібування ензиматичної активності PSA, джерело походження (Balb/c чи NZB миші). З урахуванням цих характеристик було сформовано принцип використання мАт для конструювання ІФА для визначення різних форм PSA (вільна молекула та зв’язана з α1-ACT). Для різних діапазонів концентрацій PSA було оцінено доцільність сумісного використання різних мАт для визначення вільного PSA. На другому етапі роботи було проведено розробку протоколу постановки кількісного ІФА (визначення кількості компонентів реагентів, оптимальних часових і температурних показників для всіх етапів аналізу). На фінальному етапі дослідження проводили валідацію розробленого ІФА, визначаючи такі показники: діагностична специфічність, лінійність, межі виявлення та кількісного визначення (аналітична чутливість), прецизійність, правильність (точність).Висновки. Антитіла епітопів Р2 і Р4 (і різних груп специфічності) являють собою найбільш оптимальну комбінацію для “сендвіч”-варіанта ІФА для визначення вільного PSA. Сорбційно-детекційна здатність різних пар мАт корелює з їх афінністю. Найкращими антитілами для використання для сорбції на твердій фазі були антитіла 26В9, 21В7 і 11G5 епітопу Р2 (ІІ група специфічності), а для детекції – 14С8 і 21D7 епітопу Р4 (І група специфічності). Найбільш виражені сорбційно-детекційні властивості мала пара високоафінних мАт 26В9–14С8. Сумісне використання імуноферментних кон’югатів мАт 14С8 і 21D7 приводить до підвищення чутливості при дослідженні концентрацій PSA у діапазоні 1–10 нг/мл. Валідаційні характеристики визначали на момент випуску імуноферментного набору та на момент закінчення строку придатності (1 рік). Середнє значення діагностичної специфічності становить 100,6 %. Методика є лінійною в діапазоні 0,1–30 нг/мл, невизначеність калібрувального графіка є незначущою. Розрахункова межа виявлення становить 0,001782 нг/мл, а межа кількісного визначення (аналітична чутливість) збігається з межею відтворюваності й становить 0,0054 нг/мл. Правильність (систематична похибка) становить 0,03 нг/мл і є статистично незначущою.
Проблематика. Простат-специфический антиген (PSA) является ключевым маркером, используемым в мониторинге пациентов с гиперплазией предстательной железы, риском развития и раком предстательной железы. Клиническая лабораторная диагнос­тика для такого рода пациентов реализуется с использованием соответствующих серологических тестов. Средства иммуноферментной диагностики представляют собой биоаналитические продукты, на которые распространяются требования к медицинским изделиям для диагностики in vitro. Таким образом, актуальной задачей современной аналитической биотехнологии является улучшение биоаналитических и технико-экономических показателей диагностических наборов, а также их валидация как предпосылка допуска такого рода продукции на рынок.Цель работы. Научное обоснование состава и технологии получения высокоинформативного иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения свободного PSA в сыворотке (крови) человека, а также его биоаналитическая валидация на момент изготовления и конце срока годности.Материалы и методы. Для конструирования ИФА использовали ранее полученный и охарактеризованный набор моноклональных антител (мАт) к различным эпитопам PSA. Пероксидазные конъюгаты мАт синтезировали методом периодатного окисления. В работе использованы 1-й международный стандарт PSA Всемирной организации здравоохранения (WHO International Standard Prostate Specific Antigen) и сыворотки крови людей с различным содержанием PSA. Валидацию разработанного ИФА проводили по общепринятой схеме, применяемой для количественных биоаналитических методик.Результаты. На первом этапе работы было проведено определение оптимальной конфигурации мАт для разработки неконкурентного “сэндвич”-варианта ИФА. Исследуемые мАт были охарактеризованы по следующим показателям: активность в ИФА (по отношению к PSA, его комплексу с α1-антихимотрипсином (α1-ACT) и к родственному белку калликреину-2), изотип, титр, константа аффинности, сравнительная эпитопная специфичность, степень ингибирования энзиматической активности PSA, источник происхождения (Balb/c или NZB мыши). Исходя из данных характеристик был сформирован принцип использования мАт для конструирования ИФА для определения различных форм PSA (свободная молекула и связанная с α1-ACT). Для различных диапазонов концентраций PSA была оценена целесообразность совместного использования различных мАт для определения свободного PSA. На втором этапе работы была проведена разработка протокола постановки количественного ИФА (определение количества компонентов реагентов, оптимальных временных и температурных показателей для всех этапов анализа). На финальном этапе исследования проводили валидацию разработанного ИФА, определяя следующие показатели: диагности­ческую специфичность, линейность, пределы обнаружения и количественного определения (аналитическая чувствительность), прецизионность, правильность (точность).Выводы. Антитела эпитопов Р2 и Р4 (и различных групп специфичности) представляют собой наиболее оптимальную комбинацию для “сэндвич”-варианта ИФА для определения свободного PSA. Сорбционно-детекционная способность различных пар мАт коррелирует с их аффинностью. Лучшими антителами для использования для сорбции на твердой фазе были антитела 26В9, 21В7 и 11G5 эпитопа Р2 (II группа специфичности), а для детекций – 14С8 и 21D7 эпитопа Р4 (I группа специфичности). Наиболее выраженные сорбционно-детектирующие свойства имела пара высокоаффинных мАт 26В9–14С8. Совместное использование иммуноферментных конъюгатов мАт 14С8 и 21D7 приводит к повышению чувствительности при исследовании концентрации PSA в диапазоне 1–10 нг/мл. Валидационные характеристики определяли на момент выпуска иммуноферментного набора и на момент окончания срока годности (1 год). Среднее значение диагностической специфичности составляет 100,6 %. Методика является линейной в диапазоне 0,1–30 нг/мл, неопределенность калибровочного графика является незначимой. Расчетный предел обнаружения составляет 0,001782 нг/мл, а предел количественного определения (аналитическая чувствительность) сов­падает с пределом воспроизводимости и составляет 0,0054 нг/мл. Правильность (систематическая погрешность) составляет 0,03 нг/мл и является статистически незначимой.
Background. Prostate-specific antigen (PSA) is a key marker used in the monitoring of patients with prostate hyperplasia, risk of deve­lopment and cancer of prostate. Clinical laboratory diagnostics for such patients are implemented using appropriate serological tests. Enzyme immunoassay kits are bioanalytical products that are subject to the requirements for medical devices for in vitro diagnostics. Thus, the urgent task of modern analytical biotechnology is improving bioanalytical, technical, and economic indicators of diagnostic kits, as well as their validation, as a prerequisite for the admission of such products to the market.Objective. Scientific substantiation of the composition and technology of highly informative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test-kit for the quantitative determination of free PSA in human serum (blood), as well as its bioanalytical validation at the time of manufacture and expiry date.Methods. A previously prepared and characterized set of monoclonal antibodies (mAb) to different PSA epitopes was used to construct ELISA. Peroxidase conjugates of mAbs were synthesized by periodate oxidation. We used the WHO Prostate Specific Antigen International Standard and the human serum with different PSA amount. The validation of the developed ELISA was performed according to the conventional scheme used for quantitative bioanalytical methods.Results. At the first stage of the work, the determination of the optimal mAbs configuration was carried out for the development of a non-competitive sandwich ELISA. The mAbs studied were characterized by the following indicators: activity in ELISA (relative to PSA, its complex with α1-antihymotrypsin (α1-ACT) and related protein kallikrein-2), isotype, titer, affinity constant, comparative epitope specificity, degree of PSA enzymatic activity inhibition, source of origin (Balb/c or NZB mouse). Based on these characteristics, the principle of using mAbs to construct ELISA for the determination of various forms of PSA (free molecule and one associated with α1-ACT) was formed. For different ranges of PSA concentrations, it was assessed the feasibility of sharing different mAbs to determine free PSA. At the second stage of the work, a protocol for the quantitative ELISA was formulated (determination of the number of reagent components, optimal time, and temperature indicators for all stages of the analysis). At the final stage of the study, we carried out validation of the developed ELISA, de­termining the following indicators: diagnostic specificity, linearity, limit of detection and quantification (analytical sensitivity), precision, correctness (accuracy).Conclusions. The antibodies of the epitopes P2 and P4 (and different specificity groups) are the most optimal combination for the sandwich ELISA to determine free PSA. The sorption-detection ability of different mAb pairs correlates with their affinity. Antibodies 26B9, 21B7, and 11G5 of the P2 epitope (group II specificity) were the best antibodies for use in solid phase sorption, and antibodies 14C8 and 21D7 of the epitope P4 (group I specificity) were the best ones for detections. The pair of high-affinity mAbs 26B9 and 14C8 possessed the most pronounced sorption-detection properties. The combined use of the mAbs 14C8 and 21D7 enzyme conjugates leads to increased sensitivity in the study of PSA concentrations in the range of 1–10 ng/ml. Validation characteristics were determined at the time of kit release and at the end of the shelf life (1 year). The average value of diagnostic specificity is 100.6%. The technique is linear in the range of 0.1–30 ng/ml, the uncertainty of the calibration graph is insignificant. The estimated detection limit is 0.001782 ng/ml, and the limit of quantification (analytical sensitivity) coincides with the reproducibility limit and is 0.0054 ng/ml. The correctness (systematic error) is 0.03 ng/ml and is statistically insignificant.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: