CONSTRUCTION OF METHYLOTROPHIC YEAST HANSENULA POLYMORPHA STRAINS OVERPRODUCING FORMALDEHYDE REDUCTASE

Autor: Парижак, C. Я.
Jazyk: ukrajinština
Rok vydání: 2013
Předmět:
Zdroj: Microbiology&Biotechnology; № 3(23) (2013); 14-22
Микробиология и биотехнология; № 3(23) (2013); 14-22
Мікробіологія і біотехнологія; № 3(23) (2013); 14-22
ISSN: 2076-0558
2307-4663
Popis: Метою даної роботи було отримати рекомбінантні штами термотолерантних метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha надпродуцентів формальдегідредуктази (ФР), які можуть мати біоаналітичне використання. Методи. Дріжджі вирощували на синтетичному середовищі Беркгольдера (СБ) з наступним складом (у г /л): КН2РО4 – 1; (NH4)2SO4 – 3,5; MgSO4½7H2O – 0,5; CaCl2 – 0,1; зі стандартною кількістю мікроелементів та 0,05% (в/о) дріжджового екстракту. Джерелом вугл ецю слугували 1% гл юкоза (в/о) або 1% метанол (по об’єму). Загальні активності ферментів у безклітинних екстрактах визначали спектрофотометрично (Shimadzu-UV-1650) при 340 нм за швидкістю утворення NADH – для алкогольдегідрогенази (АДГ) чи утилізації NADH – для ФР, при кімнатній (20–25 °С) температурі. Питому активність (ПА) для кожного ферменту (в мкмоль·хв–1·мг–1 білка) розраховували за формулою: ПА = ПА+субстрат – ПА–субстрат, яка враховує неспецифічні фонові реакції. Результати. Сконструйовано плазміду експресії р21Sc21, що містить ген ADH1 Saccharomyces cerevisiae, під контролем сильного конститутивного промотора гена гл іцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAP1) H. рolymorpha. Дріжджові клітини H. polymorpha NCYC 495 (leu1-1) трансформували методом електропорації. Відбір інтегрантів проводили за резистентністю до зеоцину. Наявність у геномі трансформантів рекомбінатної плазміди, що містить ген ADH1 S. cerevisiae, перевіряли за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Висновки. Рекомбінантні штами характеризувались в 4–6 разів вищою активністю АДГ та в 2–3 рази вищою активністю ФР в безклітинних екстрактах порівняно з вихідним штамом. Стабільні трансформанти виявились резистентними до підвищених концентрацій формальдегіду (до 10 мМ) у ростовому метанольному середовищі.
Целью данной работы было получить рекомбинантные штаммы термотолерантных метилотрофних дрожжей Hansenula polymorpha сверхпродуцентов формальдегидредуктазы (ФР), которые могут иметь биоаналитическое использование. Методы. Дрожжи выращивали на синтетической среде Беркхольдера следующего состава (г/л): КН2РО4 – 1; (NH4)2SO4 – 3,5; MgSO4½7H2O – 0,5; CaCl2 – 0,1; со стандартным содержанием микроэлементов и 0,05% (в/о) дрожжевого экстракта. Источником углерода служили 1% (в/о) глюкоза или 1% метанол (по объему). Активности ферментов в бесклеточных экстрактах определяли спектрофотометрически (Shimadzu-UV-1650) при 340 нм по скорости образования НАД Н – для алкогольдегидрогеназы (АД Г) – или его потребления для формальдегидредуктазы (ФР), при комнатной (20–25 °С) температуре. Активность (А) для каждого фермента (в мкмоль∙мин–1∙мг–1 белка) вычисляли по формуле: А = А+субстрат – А–субстрат, учитывающей неспецифические фоновые реакции. Результаты. Сконструирована плазмида экспрессии р21Sc21, содержащая ген ADH1 Saccharomyces cerevisiae, под контролем сильного конститутивного промотора гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAP1) H. рolymorpha. Дрожжевые клетки H. polymorpha NCYC 495 (leu1-1) трансформировали методом электропорации. Отбор интегрантов осуществляли по устойчивости к зеоцину. Наличие в геноме трансформантов рекомбинантной плазмиды, содержащей ген ADH1 S. cerevisiae, проверяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР ). Выводы. Рекомбинантные штаммы характеризовались в 4–6 раз высшей активностью алкогольдегидрогеназы (АД Г) и в 2–3 раза высшей активностью формальдегидредуктазы в бесклеточных экстрактах по сравнению с исходным штамм ом. Стабильные трансформанты оказались резистентными к повышенным концентрациям формальдегида (до 10 мМ ) в ростовой метанольной среде.
The aim of the presented work was to obtain recombinant strains of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha overproducing formaldehyde reductase (FR) which could be used bioanalyticaly. Methods. The yeast cells were grown in a synthetic Burkholder medium containing the following (g/l): КН2РО4 – 1; (NH4)2SO4 – 3.5; MgSO4½7H2O – 0.5; CaCl2 – 0.1; with the standard content of trace elements and 0.05% (wt/vol) yeast extract. 1% (wt/vol) glucose or 1% methanol (vol/vol) served as the sources of carbon. Enzyme activities in the cell-free extracts were determined by spectrophotometry (Shimadzu-UV-1650) at 340 nm by the rates of NADH formation for alcohol dehydrogenase (ADH), or NADH uptake for formaldehyde reductase (FR) at room temperature (20–25 °C). The activity (A) for each enzyme (in μmol∙min–1∙mg–1 protein) was calculated by the formula: A = A+substrate – A–substrate, taking into account the nonspecific background reactions. Results. We constructed the expression plasmid р21ADH1Sc contained ADH1 Saccharomyces cerevisiae gene under the strong constitutive promotеr of the H. polymorpha glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene (GAP1). H. polymorpha NCYC 495 (leu1-1) yeast cells were transformed by electroporation. Selection of the integrants was carried out in accordance with their resistance to zeocine. Presence of the recombinant plasmid, containing the ADH1 S. cerevisiae gene, in genome of transformants was checked using polymerase chain reaction (PCR). Conclusions. Recombinant strains were characterized by 4–6 times higher activity of alcohol dehydrogenase (ADH) and 2–3 times higher activity of FR in cellfree extracts, compared to the parental strain. Stable transformants have elevated resistance to formaldehyde (up to 10 mM) in methanol containing medium.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: